ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE VEGETAIS FOLHOSOS PROVENIENTES DE AGRICULTURA FAMILIAR

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Outro fato que deve ser observado é a capacidade de alguns micro-organimos formarem biofilme (PASTERMAK, 2009). O biofilme pode ser definido como uma comunidade de micro-organismos aderidos a uma superfície, produzindo polímeros extracelulares e interagindo uns com os outros, desta forma estão fortemente aderidos a uma superfície por meio de filamentos de natureza protéica ou polissacarídica (ROSSI; PORTO, 2009).

Devido ao risco de contaminação de produtos agrícolas pelas práticas inadequadas e visando a necessidade de orientar os agricultores quanto a estes riscos, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a presença de bactérias do grupo coliformes totais (CT), termotolerantes (CTT), Escherichia coli e Salmonella sp. em vegetais folhosos provenientes de agricultura familiar, assim como avaliar a capacidade de formação de biofilme na superfície folhosa de hortaliças.

Material e Métodos

Avaliação da presença de bactérias

As amostras de vegetais folhosos provenientes de agricultura familiar foram obtidas da feira do produtor da cidade de Londrina-PR. Foram analisadas 38 amostras, sendo estas: 9 agriões, 10 alfaces, 11 almeirões e 8 rúculas.

Os vegetais foram acondicionados em sacos plásticos estéreis e preservados em temperatura inferior a 10ºC e encaminhadas ao laboratório para o início das análises que foram realizadas em no máximo de 24 horas após a sua coleta. As análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Microbiologia Ambiental da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Câmpus Londrina.

Para o processamento inicial das amostras foi pesado 25 g de amostra e colocadas em 225 mL de água peptonada 0,1% estéril, e foi homogeneizada durante 30 segundos. O homogeneizado correspondeu a diluição 10-1 para proceder as análises de Coliformes Totais (CT) e Coliformes Termotolerantes (CTT). Para a proceder a análise de Salmonella sp. a amostra homogeneizada foi incubada durante 24 horas (36°±1).

Para a averiguação da presença de Salmonella sp. nas amostras foi transferido 1 mL do homogeneizado para um tubo com 9mL de caldo tetrationato e incubado novamente a 36°C(±1) por 24 horas. Após a incubação o caldo foi semeado por esgotamento em placas de Petri contendo Ágar XLD (Xilose-Lisina-Desoxicolato) e posteriormente as mesmas foram incubadas a 36°C(±1) por 24 horas. As colônias que apresentaram resultados característicos foram, posteriormente, submetidas a testes morfotintoriais (coloração de Gram) e bioquímicos de identificação (TSI - Tríplice Açúcar Ferro e Citrato de Simmons). A morfologia típica de Salmonella sp. em Ágar XLD são: colônias cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias com centro preto grande e brilhante ou mesmo inteiramente pretas.

Para a análise de Coliformes Totais e Termotolerantes foi utilizado a Técnica do Número Mais Provável – NMP baseado na metodologia descrita por Kornacki e Johnson (2001). Para a prova presuntiva foi utilizado o homogeneizado, obtendo assim a diluição 10-1. Através desta diluição obtiveram-se as diluições 10-2 e 10-3, também em água peptonada 0,1%. Com uma pipeta estéril foram adicionadas porções de 1 mL das respectivas diluições 10-1, 10-2 e 10-3 em uma série de três tubos contendo 9 mL de caldo Lactose com tubos de Durhan invertido. Os tubos foram incubados a 36°C(±1) por 24 horas. Em caso de crescimento, produção de gás observada no tubo de Durhan (considerada como positivo), passou-se para os testes confirmativos de Coliformes Totais e posteriormente para Termotolerantes.

A partir de cada tubo positivo de caldo Lactose (um por diluição), foi transferida uma alçada para três tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile 2% (CVBB), os quais foram incubados a 36°C(±1) por 24 horas. A presença de gás no tubo de Durhan e a turbidez do meio observada indicava a positividade do tubo para a presença de CT. O cálculo do NMP/g foi determinado com o auxílio da tabela de NMP- série de três tubos.

Dos tubos positivos contendo CVBB, foi realizado teste confirmativo para Termotolerante. Foi transferida uma alçada do caldo CVBB para tubos contendo 9 mL de caldo E.C., com tubos de Durhan invertidos. Posteriormente os tubos foram incubados a 45°C(±1) por 24 horas e observava-se o crescimento (turbidez) com a produção de gás no tubo de Durhan. Os tubos positivos foram determinados pela tabela de NMP.

Dos tubos positivo de E.C., foi retirada uma alçada de amostra e semeado por técnica de esgotamento em placas de Petri contendo Ágar MFC e incubadas a 36°C(±1) por 24 horas. As colônias típicas (colônias de cor azul escuro) foram submetidas a testes morfotintoriais e bioquímicos de identificação (Citrato de Simmons) para confirmação. Foram considerados positivos para E. coli os resultados que apresentaram teste de citrato negativos (sem mudança de cor) e coloração para Gram negativo.

Avaliação da formação de biofilme

A análise de capacidade de formação de biofilme em superfície de vegetais folhosos foi baseado na metodologia descrita por Chang e Fang (2007), com modificações. As colônias de Escherichia coli. e Salmonella sp. isoladas dos vegetais folhosos analisados, foram inoculadas em meio contendo meio sólido BHI e depois incubadas a 36°C(±1) durante 24 horas. As colônias desenvolvidas foram inoculadas em solução salina 0,85% até atingir a turvação ajustada por comparação visual à suspensão padrão nº 0,5 da escala MACFARLAND a qual representa uma amostra com 1,5.108 células bacterianas. Posteriormente realizou-se diluições seriadas em tubos de ensaio contendo água destilada estéril (9 mL) até alcançar a concentração de 1,5.105.

A partir da amostra preparada com número conhecido de células bacterianas, realizou-se o contato entre a superfície em que se formaria o biofilme e a amostra bacteriana. A superfície utilizada foi folha de alface (Lactuca sativa) recortadas no tamanho de 1x1 cm, que foram desinfetadas, em submersão em solução de hipoclorito de sódio (200 ppm), posteriormente retirou-se o resíduo do sanitizante com banho em água destilada estéril.

Na sequência submergiram-se as folhas de alface com a amostra bacteriana durante 4 horas a 36°(±1). Após o período de incubação, realizou-se lavagem das superfícies vegetais com água destilada estéril, posteriormente cada folha foi inserida em um tubo de ensaio contendo solução Tween 0,8% (10 mL) estéril, e levada a Vortex por período de 1 minuto. Com a solução bacteriana obtida, realizou-se