A Imunofluorescência direta e indireta

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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

A imunofluorescência indireta (IFI) apresenta um importante auxílio diagnóstico nas dermatoses vesicobolhosas autoimunes (DVB), como também permite a avaliação de auto-anticorpos circulantes, sendo, muitas vezes, possível a correlação clínico-laboratorial dos doentes. A técnica de IFI aplicada a estudos de anticorpos circulantes nas DVBs utiliza como substrato o epitélio normal. Os substratos variam de acordo com os protocolos de cada laboratório, mas, em nosso meio, a pele normal humana obtida de prepúcio, mama ou pálpebra é considerada ideal (fácil obtenção, boa antigenicidade), substituindo o esôfago de macaco.

A sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível de fluorescência detectável pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescência indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. Pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou anticorpos.

PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS

Consiste na incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo especifico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando á formação de um imunocomplexo. Após a lavagem, a preparação é incubada com um conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espécie de animal.

Esta técnica apresenta vantagens com relação à direta. É mais sensível, pois o anticorpo não marcado tem mais sítios de ligação que o antígeno, ou seja, ocorre uma amplificação com o uso de dois anticorpos, é mais fácil de ser controlada; pode-se utilizar um único conjugado para diferentes sistemas. Por exemplo, se for empregado anticorpo, especifico para o anticorpo obtido em coelho, o conjugado será imunoglobulina anticoelho marcada. Como desvantagem, necessita de mais tempo em mais reagente e pode ser menos especifica. O teste pode ser utilizado nos mesmos sistemas que empregados o método direto, com um aumento de sensibilidade. Como por exemplo, cite-se a pesquisa de plasmódio em hemácias.

PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS

O teste de imunofluorescência, descrito por Weller Coons em 1954, tem sido muito empregado na rotina laboratorial para a detecção de anticorpos no soro e em outros fluidos biológicos. Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitido a formação de complexo antígeno-anticorpo. Após lavagens, a preparação é incubada com conjugado (fluoresceína ligada á antiimunoglobulina) reage com anticorpo especifico para o antígeno. Utilizando diluição seriadas do soro é possível determinar o titulo de anticorpos, que será a máxima diluição em que se observa fluorescência.

Quando se deseja detectar anticorpo especifico de uma determinada classe ou subclasse de imunoglobulinas, é necessário o emprego de anti-soros específicos para as cadeias pesadas das classes que esse quer pesquisar e sem reatividade para cadeias leves ou para outras cadeias pesadas. Assim, por exemplo, conjugadas anti-IgG possuem reatividade contra as cadeias leves, detectam anticorpos contra todas as classes de imunoglobulinas reagentes.

A maior intensidade de fluorescência que esse observa nas técnicas indiretas se deve ao maior numero de moléculas fluorescentes que irão corresponder a cada determinantes antigênicos. A imunofluorescência Indireta é o teste de referencia na sorologia de muitas doenças. Apresenta varias vantagens, pois é sensível, especifica e reprodutível, de padronização e execução simples, o mesmo conjugado pode ser utilizado em sistemas diferentes e podem determinar as classes e subclasses de anticorpos empregando-se conjugados específicos.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Imunofluorescência direta e indireta. An Bras Dermatol. 2010; 85(4): 490-496.

- Diagnostico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes,

Antônio Walter Ferreira Sandra L. M. Àvila. – 2. Ed.2011 (pág. 17 a 20)

- O papel da imunofluorescência direta na fisiopatologia e no diagnóstico diferencial da estomatite aftóide recorrente, Niels Salles Willo Wilhelmsen, Raimar Weber, Ivan Dieb Miziara, Universidade de São Paulo. 2008.