Os protocolos de extração de DNA genômico consistem de cinco etapas básicas

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MATERIAL NECESSÁRIO

- Água ultrapura

- Amostras de DNA

- Cubetas de quartzo (desengorduradas e limpas com lenço de papel)

- Espectrofotômetro para luz UV

- Jogo de micropipetas e ponteiras

- Tubos de polipropileno de 1,5 mL para microcentrífuga

METODOLOGIA

- Ligar o espectrofotômetro 30 minutos antes da leitura (aquecendo a luz ultravioleta);

- Obter 500 μL de DNA diluído em água ultrapura a 1:50 (ex: 10 μL da amostra de DNA diluída em 490 μL de água ultrapura);

- Ajustar o comprimento de onda para 260 ηm e zerar o espectrofotômetro com 500 μL de água ultrapura;

- Efetuar a leitura da amostra diluída de DNA;

- Ajustar o comprimento de onda para 280 ηm e zerar o espectrofotômetro com 500 μL de água ultrapura;

- Efetuar a leitura da amostra novamente;

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Os dados abaixo exemplificam os resultados obtidos em uma leitura:

- Leitura da amostra a 260 ηm: 0,5

- Leitura da amostra a 280 ηm: 0,25

- Diluição da amostra: 1/100

A pureza da amostra será calculada pela fórmula: A260/A280: 0,5/0,25 = 2,0 que corresponde a uma amostra de boa qualidade.

A concentração de DNA é calcula pela fórmula: = valor da leitura em A260 x 50 x fator de diluição = 0,5 x 50 x 100 = 2500 μg/mL. Se o volume de amostra é de 100 μL, então a quantidade de DNA obtida é de 250 μg.

Extração de DNA Genômico pelo método Fenol-Clorofórmio

1. Centrifugar a amostra (1.500rpm x 10 minutos) e lavar 2x em PBS gelado pH 7,2.

2. Homogeneizar o tecido com auxilio de um pistilo em tubo eppendorf.

3. Suspender o pellet em tampão de extração (o volume do tampão deve ser de 4x o volume do pellet). É necessário uma concentração de 50µg de Proteinase K/ml de tampão de lise (estoque PK a 250µg/µl, logo usar 2µl do referido estoque para cada 1ml de tampão de lise), incubar 42°C por pelo menos 1h. Adicionar a Proteinase K somente na hora do uso.

4. Adicionar igual volume de Fenol equilibrado, misture com cuidado (sob agitação) por 10 minutos e centrifugar por 10 minutos a 14.000g em temperatura ambiente.

5. Se a fase aquosa aparecer “nebulosa”, adicionar um igual volume de clorofórmio, misture com cuidado e centrifugue (spin) a 14.000g por 10 minutos. (passo 8)

6. Se a fase aquosa aparecer clara, transferir a mesma para um novo tubo (cuidando para não levar a fase oleosa).

7. Adicionar o mesmo volume de uma mistura Fenol-Clorofórmio (1:1), misture por inversão do tubo com cuidado por 10 minutos.

8. Centrifugar por 10 minutos a 14.000g, preferencialmente a 4°C ou alternativamente em temperatura ambiente (TA).

9. Transferir a fase líquida para um tubo limpo e adicione um volume igual de clorofórmio e misture cuidadosamente por 10 minutos, centrifugar a 14.000g por 10 minutos a 4°C ou em TA.

10. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar o volume de 1/10, de uma solução 3M de acetato de sódio pH 5,2 e 2,5x o volume total de etanol 100% gelado.

11. Incubar em geladeira 4oC por 15 minutos.

12. Centrifugar por 30 minutos a 14.000g em 4°C ou TA.

13. Descartar o sobrenadante e lavar o pellet duas vezes com 500µl de etanol 70% gelado, centrifugando por 10 minutos a 14.000g a 4°C ou TA.

14. Secar, invertendo o tubo em TA por 10 minutos (cuidando para não perder completamente o pellet)

15. Suspender o pellet em 50µl de TE (pode-se incubar o pellet por alguns minutos a 60ºC para auxiliar na solubilização)

16. Tratar com 1 µl de RNAse (estoque a 10 µg/ml) por 1 hora a 37ºC.

17. Para utilização em PCR de baixa estringência, re-extrair o DNA a partir do passo 8.

18. Checar a concentração de DNA em espectofotômetro ou em gel de agarose e estocar a –20ºC.

Tampão de lise (20ml):

10mM Tris pH 7,4 para se fazer 20ml utilize: 200µl de Tris 1M

10mM NaCl 200µl de NaCl 1M

25mM EDTA 1ml de EDTA 0,5M

1% SDS 2ml de SDS 10%

16,6ml de H2O milliq

Extração de DNA Genômico

1. Centrifugar a amostra (6.000rpm x 10 minutos) e lavar 2x em TE gelado pH 8,7.

2. Homogeneizar a amostra com auxílio de uma ponteira em tubo eppendorf.

3. Suspender o pellet em 800µL de TE (contendo 10,3% wt/vol de glicose e 10mg/mL de lisozima incubar por 4 a 12 horas a 37°C overnight).

4. Adicionar 100µL de SDS a 10%, 20µL de NaCl a 5 M e 13µLde proteinase K a 20%, homogeneizar por inversão e incubar por 12 horas a 56ºC.

5. Adicionar aproximadamente o mesmo volume da amostra de fenol (700 a 800µL) agitar levemente em mesa agitadora por 20 min. e centrifugar por 10 min a 10.000 g. Transferir a fase aquosa para um tubo de 2 mL estéril.

6. Adicionar aproximadamente o mesmo volume da amostra de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) agitar levemente em mesa agitadora por 20 min. e centrifugar por 10 min a 10.000 g. Transferir a fase aquosa (sobrenadante) para um tubo de 2 mL estéri)

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7. Adicionar aproximadamente o mesmo volume da amostra de clorofórmio:álcool isoamílico