Microbiologia 2016

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Figura 1: Teste presuntivo em triplicata nas diluições 10-1,10-2 e 10-3

A partir dos tubos com formação de gás, semeou-se por alçada em tubos contendo caldo de bílis (VB) onde incubou-se os mesmos a 35oC por 48 horas. A possível formação de gás constituI teste positivo para coliformes totais.

Também através dos tubos positivos do teste presuntivo, transferiu-se com uma alça de platina uma pequena porção do meio para o mesmo número de tubos contendo caldo EC (Escherichia coli), posteriormente, incubou-se os mesmos a 44,5°C por 48h. A presença de gás no interior dos tubos de Durhan é considerada uma reação positiva, indicadando contaminação de origem fecal.

Para a detecção de Escherichia coli em cada tubo de caldo EC com produção de gás estriou-se uma alçada de cultura nas placas de Àgar Eosina Azul de Metileno (EMB), incubando-as aproximadamente à 35°C durante 24h e observou-se se houve desenvolvimento de colônias típicas de E. coli (nucleadas com centro preto, com ou sem brilho metálico). Na confirmação de colônias típicas, transferiu-se duas colônias bem isoladas de cada placa para tubos de Ágar Padrão Contagem (PCA), inclinados, incubando-se os tubos a aproximadamente 35°C por 24h. A próxima etapa iniciou-se a partir das culturas puras em PCA, na qual fez-se o teste de coloração Gram, inoculando-se os meios para realização de provas bioquímicas de VM e VP e citrato. A Figura 2 estão representados os materiais utilizados para a deteção dos coliformes totais e termotolerantes(VB E EC) a partir do teste presuntivo.

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Figura 2: Materiais utilizados para confirmação de coliformes totais e termotolerantes.

O teste de citrato consistiu na transferência de um inóculo leve da cultura para a rampa dos tubos de ágar Citrato de Simmons, incubando-os a 35°C durante 96h, observando o crescimento e coloração do meio para confirmação de teste negativo ou positivo, sendo respectivamente a descrição dos mesmos, crescimento com viragem alcalina e alteração da cor do meio de verde para azul, não crescimento e a não alteração da cor do meio.

Para a prova bioquímica do teste vermelho de metila transferiu-se uma alçada com inóculo leve da cultura para um tubo com caldo VM-VP, incubando-o aproximadamente a 35°C durante 48h. Na leitura foi adicionado 10 gotas de uma solução de vermelho de metila, observando imediatamente se o meio adquiriu uma coloração vermelha (teste positivo) ou amarela (teste negativo). As cepas de E. Coli são VM positivas.

Já no teste de Voges-Proskauers transferiu-se uma alçada com inóculo leve da cultura, incubando-o a 35°C durante 48h. Adicionou-se 3 mL de solução de α-naftol 5% e agitou-se, após adicionou-se 1 mL de solução de KOH 40%, agitando novamente. Deixou-se descansar, observando periodicamente por 1 hora o desenvolvimento de uma cor vermelha ou rósea no meio de cultura (teste positivo). A permanência do meio na cor do reagente (amarelada ou ligeiramente esverdeada) indica teste negativo. As cepas de E. Coli são VP negativas.

A coloração diferencial de Gram foi conduzida através do preparo de esfregaço, na qual, retirou-se o inóculo da cultura de 24h previamente preparada em ágar nutriente e, sequencialmente, colocou-se uma gota de solução salina estéril em uma lâmina limpa e seca, flambou-se a alça de Drigalski, esfriando-a na parede do tubo de ensaio com a cultura, retirando uma pequena quantidade da colônia bacteriana. Dessa forma, espalhou-se o material coletado sobre a lâmina, homogeneizando com a solução salina de maneira a obter um esfregaço fino, posteriormente, secou-se a temperatura ambiente, fixando o esfregaço passando próxima a chama do bico de Bunsen. Assim, procedeu-se à coloração propriamente dita.

A técnica de coloração de gram garantiu que toda a lâmina com solução de Cristal Violeta (GRAM I) se cobri-se, aguardando 1 minuto, logo depois desprezou-se o corante, por seguinte, cobriu-se a lâmina com Lugol (GRAM II), que foi preparado na hora do uso, aguardou-se 1 minuto e 30 segundos, desprezando o corante e em sequência, inclinou-se a lâmina, gotejando Álcool-acetona (GRAM III) até que não se observasse desprendimento do corante, cerca de 30 segundos e assim, lavou-se a lâmina, secando-a (sem esfregar). Após, cobriu-se com Fucsina básica (GRAM IV), aguardando 30 segundos a lavou, secando-a (sem esfregar). Observou-se ao microscópio com objetiva de imersão. A seguir, na Figura 3 estão exemplificados o preparo do esfregaço e a técnica de coloração de gram conduzidos neste experimento.

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Figura 3: Preparo de esfregaço e técnica de coloração de gram.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Primeiramente, pelo teste presuntivo, confirmou-se a presença de coliformes totais nas diluições 10-1 e 10-2, na qual a combinação observada foi 2-2-0, onde confirmou-se a turvação do meio na amostra de carne moída. Após o teste presuntivo, realizou-se o teste de confirmação para coliformes totais e coliformes termotolerantes, com observância à confirmação do mesmo, que é positivo quando há produção de gás no interior dos tudos de Durhan.

Embora a legislação vigente não estabeleça limites de contaminação por coliformes totais, sua presença em altas contagens em um alimento indica falhas higiênicas ao longo do processamento e armazenamento do produto. Já a pesquisa de coliformes termotolerantes, fornece com maior segurança informações sobre as condições higiênicas do produto e melhor indicação da eventual presença enteropatógenos, indicando contaminação de origem fecal(DIAS).

Os resultados obtidos nos testes de confirmação para coliformes totais e coliformes termotolerantes são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: Contagem de coliformes totais e termotolerantes

Coliformes totais(VB)

Combinação

Resultado (NMP/g)

3

1

0

3-1-0

430

Coliformes termotolerantes(EC)