Laboratório de microbiologia

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Para a identificação das bactérias Gram negativas, faz-se necessário o uso de testes bioquímicos com o uso de meios de cultura e reagentes. Os testes bioquímico são: Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), Ágar Simmons Citrato, Meio SIM, Ágar Lisina-Ferro, Caldo MR/VP, Caldo Uréia. De acordo com o tipo de reação que ocorre nesses testes, é possível identificar um número elevado de bactérias.

- Cultura e isolamento de Salmonella spp.:

Alguns micro-organismos possuem um nível de exigência mais elevado para o crescimento in vitro, dentre eles a Salmonella é uma bactéria que necessita de meios de cultura diferenciados para o seu isolamento, não crescendo em meios de cultura convencionais.

As amostras encaminhadas ao Laboratório com o intuito de isolar esse gênero são inicialmente pré-enriquecidas em água peptonada tamponada a 1% e incubadas a 37ºC por 24 horas. Posteriormente, transfere-se 1 mL para o caldo tetrationato adicionado de 0,2mL de iodo iodetado e 0,1mL para o caldo Rappaport que são incubados em “shaker” a 37ºC a 70rpm durante 24 horas. A partir dos caldos de enriquecimento seletivo as amostras são semeadas em placas contendo os meios Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Ágar Verde-Brilhante e incubados a 37ºC por 24 horas. As colônias suspeitas são submetidas às provas bioquímicas em Ágar TSI, Ágar Lisina-Ferro e Caldo Uréia, incubadas a 37ºC por 24 horas, onde procede-se a leitura para a confirmação do gênero.

- Pesquisa de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes pelo Método de Ziehl-Neelsen

Esse método identifica Micobactérias patogênicas por bacterioscopia direta, que utiliza a característica destas bactérias de possuírem paredes celulares com alto teor de lipídeos (cerca de 60 %), que quando tratadas pelo corante fucsina fenicada, coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subseqüente por uma solução de álcool-ácido forte, por isso conhecidas por Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). As outras bactérias, que não possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos, têm a sua coloração pela fucsina descorada pela solução de álcool-ácido e coram-se em azul pela coloração de fundo do Azul de metileno (contra-corante).

É preparado um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca, deixada secar à temperatura ambiente, o material é fixado passando a lâmina algumas vezes através chama do bico de Bunsen. O próximo passo é cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de fucsina fenicada, e deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando algodão umedecido em álcool ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três emissões sucessivas. Deve-se evitar a fervura e secagem do corante, quando necessário adicionar mais corante durante a realização do teste para evitar que a lâmina seque. Passado o tempo previsto, lava-se a lâmina em água corrente para eliminar a fucsina. Depois de lavada, cobre-se a superfície do esfregaço com a solução de álcool-ácido. Terminada a fase de descoloração e eliminado o álcool-ácido, lavar a lâmina e cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto, lavar novamente e eperar secar para fazer a leitura em microscópio sob objetiva de imersão (100 x).

- Antibiograma

O antibiograma tem por objetivo verificar a sensibilidade de uma bactéria a determinados antibióticos. As bactérias isoladas e identificadas são inicialmente diluídas em Caldo Brain Heart Infusion (BHI). Com auxílio de um suabe estéril, os isolados são semeados em uma placa contendo Ágar Müeller Hinton. Com o auxílio de uma pinça estéril, é feita a distribuição dos discos de antibióticos separadamente na superfície do Ágar. A leitura é realizada após 24h, verificando-se o tamanho dos halos de inibição e comparando com uma tabela fornecida pelo fabricante dos discos de antibióticos.

Algumas bactérias como o Streptococcus sp. e o Corynebacterium sp. não apresentam um bom crescimento nesse meio de cultura, sendo necessário o Ágar Sangue para a realização do teste.

2.7 Pesquisa Fúngica

Os fungos são caracterizados pelas formas leveduriformes e filamentosas. Para a identificação de ambos, são necessários métodos diferenciados com uso de meios de cultura e técnicas próprias para cada tipo. Para a cultura fúngica as amostras encaminhadas podem ser de swabs (otológicos, lesões) ou amostras de pelo e raspado de pele.

A pesquisa de fungos leveduriformes, como a Malassezia sp., é inicialmente é realizada pelo exame direto, através da fricção do swab (otológico) sobre a superfície de uma lâmina limpa para microscopia. Os esfregaços obtidos são corados pelo método de Gram e em seguida analisados sob microscopia óptica em aumento de 100x com auxílio de óleo para imersão. A cultura de amostras de swabs otológicos encaminhados são semeados em Ágar Sabouraud e mantidos em temperatura de 37ºC até a observação do crescimento microbiológico.

As amostras de pelo animal são separadas em duas partes, uma para análise microscópica direta, e a segunda para cultura em Ágar Fungobiótico e Ágar Fungiobiótico adicionado com Azeite para o crescimento de leveduras. O exame microscópico direto do pelo é realizado com solução clarificadora de hidróxido de potássio (KOH) a 30%, na qual o pelo é dispensado sobre uma