Estudo da deterioração ocasionada por clostrídios psicrotróficos em carne bovina resfriada embalada a vácuo.

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INTRODUÇÃO

Para a carne fresca, a embalagem a vácuo comprovou ser eficiente em prolongar a vida útil, preservando as características sensoriais inerentes ao produto durante um período suficientemente longo para seu volume de negócios. Durante a refrigeração, o vácuo permite o aumento da vida útil da carne, evitando a oxidação e o desenvolvimento de microrganismos aeróbios. Dentre os sistemas estabelecidos de acondicionamento de carne, o vácuo é o mais utilizado no mercado institucional para a distribuição de porcionados. A produção de gás em carnes embaladas a vácuo ou blown pack é muitas vezes detectada em carnes que sofreram abuso de temperatura no processamento e armazenamento. É fato que, o problema de distensão de embalagens com carne pode ocorrer sem que tenha ocorrido abuso de temperatura, e este tem sido um desafio para a cadeia de produção, processamento e comercialização de carnes.

A deterioração causada por clostrídios psicrófilos e psicrotróficos está associada com a proteólise, perda de textura, acúmulo de líquido nas embalagens acompanhado de um odor desagradável, principalmente de gás sulfídrico.

As bactérias lácticas preservam as carnes por meio da exclusão competitiva com outros microrganismos e também por meio da produção de substâncias inibitórias, incluindo-se as bacteriocinas. A nisina, uma bacteriocina produzida por linhagens de Lactococcus lactis subsp. lactis, apresenta amplo espectro de ação. Este composto constitui-se numa bacteriocina tipo lantibiótico (formado por pequenos peptídeos ativos em membranas), possui atividade bactericida sobre muitos microrganismos gram-positivos e previne o crescimento pós-germinativo de esporos, como os de Clostridium botulinum (Gould, 1996).

Para isolamento e identificação de Cl. estertheticum e Cl. gasigenes em carnes, o método tradicional é considerado complexo e inespecífico (BRODA et al., 2000). A inserção da técnica de PCR para diagnóstico em alimentos iniciou-se na década de 90, e hoje encontra-se mais difundida, pela redução do tempo de análise frente a métodos tradicionais e, especificidade dos microrganismos detectados. A técnica tornou-se rotina básica dos laboratórios de biologia molecular, após a descoberta da enzima Taq DNA Polimerase. Em si, a importância do PCR é devido a sua sensibilidade ao amplificar pequenas quantidades de DNA em milhões de cópias para seu seqüenciamento, clonagem, diagnóstico e outros (BRODA et al., 2000). Os objetivos desse trabalho foram estudar as características da deterioração ocasionada por clostrídios psicrotróficos em meio de cultura e em carne bovina embalada a vácuo. Determinar o potencial inibitório de bacteriocinas sobre a ação dos clostrídios psicrotróficos em meio de cultura e em carne bovina embalada a vácuo. Avaliar o potencial inibitório de sanitizantes sobre clostrídios psicrotróficos e detectar por meio de uma técnica de detecção molecular rápida a presença de clostridios psicrotróficos.

MATERIAL E MÉTODOS

Método de esporulação

Preparo de esporos

Os esporos de Cl. estertheticum, Cl.gasigenes e Cl. sporogenes foram preparados conforme a metodologia de MAH et al. (2009).

Preparo e quantificação das bacteriocinas

As culturas de Lc. lactis subsp. cremoris e Lc. lactis subsp. hordnae produtoras das bacteriocinas 204 e 484, foram ativadas em caldo MRS a 30°C por 8 e 12h respectivamente. Após ativação, os caldos brutos das bacteriocinas foram submetidos a choque térmico a 80°C por 5min, sendo em seguida resfriadas em banho com gelo por 5min. O caldo contendo as bacteriocinas após o choque térmico e resfriamento foi centrifugado por 10min a 14.000 rpm a 4ºC por 10min e os sobrenadantes contendo bacteriocinas foram utilizados.

A nisina pura apresentava atividade de 3,2x106U/g, e a partir da mesma foi preparada uma solução mãe com atividade de 1,0x105U/ml a qual foi diluida até 2,0x103U/ml e testadas frente a Cl. estherteticum e Cl. gasigenes. Cada poço foi inoculado com 100µL de cada bacteriocina.

A quantificação das bacteriocinas foi determinada pelo método de antagonismo simultâneo em poços segundo TAGG & MCGIVEN (1971), modificado por BENKERROUM et al. (1993).

Teste de produção de gás meio de cultura e em carne bovina embalada a vácuo

Os testes foram realizados com culturas produtoras de gás e blown pack (Cl. estertheticum e Cl. gasigenes).

O meio de carne utilizado no teste de verificação da produção de gás foi preparado de acordo com ROBERTS et al. (1981). A emulsão de carne formada, foi distribuída em tubos de 10 x 100mm, em porções de 2mL.

Utilizou-se cortes de contrafilé os quais foram preparados conforme BRIGHTWELL et al. (2007) porcionadas em 10g e seladas a vácuo em seladora (Supervac, GK185) com pressão 15atm e acondicionados em sacos termoencolhiveis (Perflex 51 film 4x ½ x 18 taped vácuo).

Em cada tubo contendo 2mL de meio de cultura, foram inoculados 100µL da suspensão do microrganismo a ser testado (na escala de 1MacFarland), estes foram homogeneizados em agitador de tubos tipo vortex e selados com ágar selo a 1,5% e deixados em repouso para solidificação. Os tubos inoculados em triplicata foram incubados nas temperaturas de 4°C, 7°C e 20°C. A leitura dos resultados foi realizada diariamente. Em tubos contendo as células de Cl. estertheticum, Cl. gasigenes, Cl. perfringens e Cl. sporogenes foram adicionados em duplicata para cada temperatura 100µL de extrato bruto da bacteriocina 204.

As embalagens contendo as porções de carne foram inoculadas com 1mL da suspensão de células vegetativas Cl. estertheticum, Cl. gasigenes, Cl. perfringens, Cl. sporogenes, ou solução esporos Cl. estertheticum, Cl. gasigenes e Cl. sporogenes, foram inoculadas com 1mL da bacteriocina 204 e outras com a bacteriocina 484. Junto foram separadas como controle positivo, amostras sem microrganismos, apenas cortadas e seladas a vácuo. As embalagens foram incubadas em três temperaturas 0°C, 4°C e 7°C, e a leitura de avaliação do grau de deterioração foi realizada leitura diariamente baseada na escala de classificação.

Avaliação da eficácia de sanitizantes sobre clostrídios psicrotróficos

Avaliou-se a ação dos sanitizantes hipoclorito de sódio, ácido peracetico e quaternário de amônio na inibição da germinação