Determinação completa de organismo a partir de sequencia genética

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CTTGATTAAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGGTTA

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GATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTAATCAAATAA

Essa sequência pode ser aplicada em "blastx", ainda na seção BLAST do site NCBI. Selecionando a opção "Bacteria and Archaea (11)" em "Genetic Code", o site será redirecionado à uma busca como a imagem a seguir:

[pic 2]

Como o primeiro hit trás um estudo genérico (MULTISPECIES), observa-se os hits seguintes. Logo, o segundo hit já é interessante (chitosanase [Bacillus subtilis]). Direcionando-se à "Acession" e, a seguir, a "FASTA", o site informa a sequência de aminoácidos referente.

MKISMQKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFAAGLNKDQKRRAEQLTSIFENGTTEIQYGYVERLDDGRGYTC

GRAGFTTATGDALEVVEVYTKAVPNNKLKKYLPELRRLAKEESDDTSNLKGFASAWKSLANDKEFRAAQD

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Acessando o site ExPASy no setor ENZYME, é possível obter mais informações sobre a enzima, procura-se por "Chitosanase" em "by description (official name) or alternative name(s)", assim descobrindo o EC da enzima (EC 3.2.1.132), a reação que ela catalisa (Endohydrolysis of beta-(1->4)-linkages between D-glucosamine residues in a partly acetylated chitosan) e o link direto com o site BRENDA, que será utilizado mais a seguir.

4.2 Retirada do Peptídeo Sinal

Na região n-terminal, a enzima é reconhecida como intra ou extracelular. Se ela possui um peptídeo sinal, é exportada, se não o possui, é difundida por afinidade química.

Como o propósito é clonar a enzima proposta, não é interessante que ela seja extracelular, ou seja, não é interessante que tenha peptídeo sinal. Porém, mesmo que ela venha a ter, é possível que este seja removido por uma segunda enzima que o clive.

Para descobrir se há peptídeo sinal na sequência trabalhada, o site SignalP foi consultado. Deposita-se a sequência de aminoácidos na caixa de texto e seleciona-se "Gram-positive bacteria" em "Organism group", seguindo com a pesquisa.

[pic 3]

A informação obtida disso é que há peptídeo sinal e ele se localiza entre os aminoácidos de número 29 e 30 (VFA-AG). Assim, o peptídeo sinal está sinalizado abaixo:

MKISMQKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFA AGLNKDQKRRAEQLTSIFENGTTEIQYGYVERLDDGRGYTC

GRAGFTTATGDALEVVEVYTKAVPNNKLKKYLPELRRLAKEESDDTSNLKGFASAWKSLANDKEFRAAQD

KVNDHLYYQPAMKRSDNAGLKTALARAVMYDTVIQHGDGDDPDSFYALIKRTNKKAGGSPKDGIDEKKWL

NKFLDVRYDDLMNPANHDTRDEWRESVARVDVLRSIAKENNYNLNGPIHVRSNEYGNFVIK

ATGAAAATCAGTATGCAAAAAGCAGCGATCTCATTACTTGTTTTCACTATGTTTTTTACCCTGATGATGA

GTGAAACGGTTTTTGCG GCGGGACTGAATAAAGATCAAAAACGCCGGGCGGAACAGCTGACAAGTATCTT

TGAAAACGGCACAACGGAGATCCAATATGGATATGTAGAGCGATTGGATGACGGGCGAGGTTATACATGC

GGACGGGCAGGCTTTACAACGGCTACCGGGGATGCATTGGAAGTAGTGGAAGTATACACAAAGGCAGTTC

CGAATAACAAACTGAAAAAGTATCTGCCTGAATTGCGCCGTCTGGCCAAGGAAGAAAGCGATGATACAAG

CAATCTCAAGGGATTCGCTTCTGCCTGGAAGTCGCTTGCAAATGATAAGGAATTTCGCGCCGCTCAAGAC

AAAGTAAATGACCATTTGTATTATCAGCCTGCTATGAAACGATCGGACAATGCCGGACTAAAAACAGCAT

TGGCTAGAGCTGTGATGTACGATACGGTTATTCAACATGGCGATGGTGATGACCCTGACTCTTTTTATGC

CTTGATTAAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGGTTA

AATAAATTCTTGGACGTACGCTATGACGATCTGATGAATCCGGCCAATCATGACACCCGTGACGAATGGA

GAGAATCAGTTGCCCGTGTGGACGTGCTTCGATCTATCGCCAAGGAGAACAACTACAATTTAAACGGACC

GATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTAATCAAATAA

4.3 Escolha do vetor de clonagem, sítios de restrição e sítios de clonagem

Foi disponibilizado quatro vetores diferentes: de bactérias, de plantas, de leveduras e de fungos filamentosos. A escolha preferencial foi a inserção do gene em um vetor bacteriano, levando em conta a velocidade de reprodução bacteriana e sua capacidade de comportar uma pequena massa de DNA, assim precisando de pouca enzima de restrição durante o processo.

Para isso, é necessário cortar o DNA circular do vetor utilizando enzimas que não coincidam com enzimas que cortem também o gene de interesse, já que ambos, estarão em um mesmo ambiente durante a técnica.

[pic 4]

Para descobrir quais enzimas cortam a sequência dada, consulta-se o site NEBcutter, onde é necessário inserir-se a sequência de aminoácidos sem o peptídeo sinal, selecionar a opção "Linear" em "The sequence is" e submeter, obtendo o seguinte resultado:

[pic 5]

Após a análise enzima por enzima, comparando-as, nota-se que a única enzima que não se pode usar durante a técnica é a PvuI (CGATCG), que cortaria o gene na 376º base. Tirado essa, pode-se usar quaisquer outras duas enzimas que cortem o vetor bacteriano, assim, escolhe-se Sap I e Bst1107 I, que, conforme os sites BioLabs e Thermo Scientificm, respectivamente, trabalham a temperatura ótima de 37°.

[pic 6]

4.4 Produção dos primers e do sítio de restrição

Os primers, necessários para a técnica de PCR, podem ser construídos manualmente. Para tanto, conta-se 30 bases do início e 30 bases do final de sua sequência sem o peptídeo sinal. As 30 bases do início serão o forward primer e as 30 bases do final serão o reverse primer. Porém, o reverse primer é necessário como sua fita complementar e, para achá-la, faz-se uso do site Reverse Complement.