Os Diagnósticos Moleculares

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As mutações que aumentam a produção de uma proteína normal geralmente são devidas ao aumento da dosagem gênica (uma cópia extra de cromossomo, duplicações de segmentos gênicos, descontrole do sistema de regulação da expressão, etc.), como ocorre na trissomia do par 21 (síndrome de Down), causada pelo aumento da dosagem gênica de muitas proteínas codificadas pelo cromossomo 21. Também pode ocorrer mutações de propriedade nova, onde muitas vezes a proteína ganha uma função adicional, além da que ela continua a cumprir. São muito raras, porque normalmente uma mutação reduz ou elimina uma ou mais funções da proteína, sendo o que ocorre na anemia falciforme, com mutação de um único aminoácido. Ao contrário das hemoglobinas normais, as falcêmicas agregam-se quando desoxigenadas, formando fibras que deformam as hemácias, mas sem perda da capacidade de transportar oxigênio (NUSSBAUM, 2008).

3. TESTES GENÉTICOS MOLECULARES E SUAS INDICAÇÕES

De modo geral, diagnóstico pré-natal e pré-implantacional de doenças genéticas, predisposição genética ao câncer, investigação de doenças neurológicas, diagnóstico ou estagiamento de doenças e pesquisa de agentes patogênicos são algumas das muitas aplicabilidades dos testes genéticos moleculares.

Os testes genéticos moleculares podem ser classificados de acordo com a finalidade de sua utilização como testes com finalidade diagnóstica confirmatória que são utilizados para confirmar ou excluir o diagnóstico de uma doença genética em um indivíduo sintomático; como testes com finalidade de triagem pré-natal, neonatal ou para identificação de portadores assintomáticos de uma doença autossômica recessiva ou ligada ao cromossomo sexual que não apresentam risco de desenvolver a doença, mas podem transmiti-la a sua descendência; e como testes preditivos, sejam testes pré-sintomáticos que identificam indivíduos saudáveis que mais tarde apresentarão uma doença hereditária, sobretudo doenças autossômicas dominantes de início tardio, seja testes de identificação de susceptibilidade genética a doenças comuns multifatoriais ou complexas ou testes preditivos de resposta a medicamentos (Calderón e de la Blanca, 2005).

Embora a maioria dos testes genéticos esteja voltada para doenças raras, testes destinados a identificar fatores de risco herdados de doenças comuns, tais como neoplasia maligna da mama, câncer colorretal, tromboembolismo, doença de Alzheimer, doença ateroesclerótica do coração foram desenvolvidos. Em razão destes fatores de risco herdados interagir com diversos fatores de risco ambientais, o valor preditivo dos testes genéticos moleculares para doenças comuns multifatoriais é bastante inferior ao valor preditivo daqueles voltados para doenças raras causadas por mutações em um único gene, denominadas doenças monogenéticas (Burke, Atkins, Gwinn et al., 2002).

Poe fim, os resultados dos testes genéticos moleculares têm sido integrados aos achados da história clínica, incluindo o padrão de herança, e dos estudos eletrofisiológicos e histopatológicos para estabelecer o diagnóstico definitivo, com repercussões no aconselhamento genético e nas informações a respeito de prognóstico. Neste sentido, entre as principais técnicas de diagnóstico molecular disponíveis atualmente há: Southern Blot, RFLP (Restriction fragmente lenght polymorphism), Eletroforese em campo pulsado (PFGE), microarranjos, seqüenciamento, e os dois métodos mais utilizados a que sé dará ênfase neste trabalho que é a reação em cadeia polimerase (PCR) e a Hibridação.

3.1. Southern Blot

O Southern blot é um método que serve para verificar se uma determinada seqüência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA analisada. É realizada a partir de um gel onde foi feita a eletroforese de DNA e este é tratado com uma solução alcalina (tipicamente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda. Uma membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente, nylon) é posta sobre o gel, onde é feita uma pressão uniformemente sobre o gel, fazendo com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se adere. A membrana é então aquecida ou exposta a radiação ultravioleta para permanentemente ligar o DNA à membrana. A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora que irá parear com qualquer seqüência de DNA complementar a ela. Portanto se a seqüencia procurada não estiver presente na amostra não haverá o pareamento, tornando possível determinar quais trechos a seqüência procurada está ou não presente.

3.2. RFLP (Restriction fragmente lenght polymorphism)

Dentre as diversas técnicas da Biologia Molecular, o polimorfismo por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), rusticamente traduzido como “Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição”, é uma técnica bastante utilizada para o estudo do genoma, pois indivíduos diferentes possuem seqüências de nucleotídeos diferentes ao longo da fita de DNA. Nesta técnica utilizam-se enzimas de restrição que cortam o DNA em pontos específicos, gerando fragmentos de diferentes tamanhos que são separados e visualizados em forma de bandas, de modo que os padrões de bandas de DNA obtidos podem ser comparados e as diferenças são facilmente detectadas permitindo a detecção de algumas doenças genéticas.

3.3. Microarranjo de DNA

Geralmente a técnica de microarranjo de DNA tem aplicações direcionadas para análise de expressão gênica e de mutações pontuais. Atualmente, tem-se expandido as aplicações de microarranjo para as áreas de farmacogenômica, diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas e na área forense. Basicamente, o princípio da técnica de microarranjo consiste na hibridização entre uma sonda (cDNA ou oligonucleotídeo) e uma molécula-alvo marcada com fluoróforo, usualmente um cDNA. As sondas contêm seqüências complementares às moléculas-alvo correspondendo a uma parte específica de um gene e são fixadas em uma superfície sólida através de agulhas robotizadas, fotolitografia ou por impressão a jato. O RNA mensageiro extraído das amostras a serem analisadas são utilizados como moldes para a formação do cDNA. Este cDNA é então marcado com fluoróforo para posterior hibridização, de modo que uma das aplicações da técnica de microarranjo mais utilizada é a comparação entre duas amostras distintas (por exemplo, uma