Relatório lab. de Biologia Molecular - Mitocondria

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Média: 26,66 nmol de O₂/ min mg de proteína

- NADH oxidase ( com rotenona)

(Primeira repetição)Velocidade do consumo de O₂= 190 X 0,3 X 2,5 / 17,1 X 0,625 = 13,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

(Segunda repetição) Velocidade do consumo de O₂= 190 X 0,3 X 2,5 / 17,1 X 0,625= 13,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

Média: 13,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

- Succinato oxidase ( sem malonato)

(Primeira repetição)Velocidade do consumo de O₂= 190 X 1,5 X 2,5 / 17,1 X 0,625 = 66,66 nmol de O₂/ min mg de proteína

(Segunda repetição) Velocidade do consumo de O₂= 190 X X 2,5 / 17,1 X 0,625= 53,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

Média: 59,995 nmol de O₂/ min mg de proteína

- Succinato oxidase ( com malonato): Não houve respiração, já que não houve consumo de O₂.

- Cinética da NADH desidrogenase

- Controle

6cm ----- 0,5 Abs 6cm-----0,5 Abs

2cm ----- x 1,4cm ---- x

x= 0,166 x= 0,116

Média do delta Abs= 0,141

Tempo = 15s

ε = 1,04 cm ˉ¹ mMˉ¹

Abs = ε x C x 1 → C= delta Abs/ ε x 1

C = 0,141/ 1,04 = 0,136 mM

0,136 mM de ferricianeto ---- 1000 ml

x ----- 0,017 ml ( foi a quantidade de mitocondria usada na reação....não sei se precisa explicar)

x = 2,312 µmol de ferricianeto

Conforme dados anteriores:

[proteína] = 29,41 mg/ml

29,41 mg ----- 1 ml

x ------ 0,017 ml

x= 0,5 mg de proteína

Assim: 2,312 µmol / 0,5 mg = 4,624 µmol de ferricianeto/ mg de proteína

4, 624 ----- 15 s

x ------ 60 s

x = 18,5 µmol de ferricianeto/ mg min

- Com rotenona

6cm ----- 0,5 Abs 6cm-----0,5 Abs

1,8cm ----- x 1cm ---- x

x= 0,150 x= 0,083

Média do delta Abs= 0,116

Tempo = 12s

ε = 1,04 cm ˉ¹ mMˉ¹

Abs = ε x C x 1 → C= delta Abs/ ε x 1

C = 0,116/ 1,04 = 0,112 mM

0,112 mM de ferricianeto ---- 1000 ml

x ----- 0,017 ml

x = 1,91µmol de ferricianeto

Assim: 1,91 µmol / 0,5 mg de proteína = 3,82 µmol de ferricianeto/ mg de proteína

3,82 ----- 12 s

x ------ 60 s

x = 19,1 µmol de ferricianeto/ mg min

Em relação as atividades da NADH oxidase e da succinato oxidase, observou-se que com a adição do succinato obteve-se uma maior velocidade do consumo de oxigênio do que quando utilizamos NADH como sustrato. Isso se dá porque o succinato, ao ser oxidado pelo complexo dois, não proporciona ejeção de prótons da matriz para o espaço intermembrana, rendendo assim menor potencial transmembrana e assim, menor energia livre para gerar ATP pela ATP sintase. Isso requer que a cadeia respiratória esteja mais ativa, gastando mais oxigênio por ATP. Já o NADH, quando oxidado pelo complexo I (NADH desidrogenase) permite a ejeção de quatro prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana, formando potencial eletroquímico maior do que aquele gerado pela oxidação do succinato, gerando mais ATP e necessitando de um menor consumo de O2.

Na presença de rotenona e NADH, observou-se que a velocidade do consumo de O2 caiu pela metade em relação ao controle. Isso ocorreu porque a rotenona, um composto flavonóide produzido pelo metabolismo secundário de algumas plantas que geralmente é utilizado como inseticida, inibe o fluxo de elétrons do complexo I para a ubiquinona e prejudica todo o processo de fosforilação oxidativa. Como ainda foi detectado consumo de oxigênio na presença do inibidor, é provável que a concentração deste no meio de reação não fosse suficiente para inibir todos os complexos da cadeia respiratória presentes. Já na presença de malonato e succinato, não foi detectado consumo de oxigênio. O malonato é um inibidor competitivo da succinato desidrogenase, pois se assemelha ao substrato da mesma, o succinato, impedindo que ocorra