Variante moleculares do vírus da influenza

...

Dr. Marcelo Genofre Vallada, pela seleção dos paciêntes e coleta

das amostras no Instituto da Criança da FMUSP.

Ao Alexandre Pereira pelo acompanhamento deste trabalho.

A Dra Viviane Botosso por todas as sugestões dadas para a conclusão

deste trabalho.

A Dra Rita de Cassia Stocco dos Santos por todo apoio e ajuda

dispensada a mim.

A Leonardo Setsuo Kobashi pela ajuda na finalização do trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Virologia, em especial para Jansen de

Araújo pelo apoio nos experimentos de conclusão desta Dissertação.

A Nair Aparecida da Silva Pereira, pelo apoio prestado durante a

execução deste trabalho e pelo incentivo dado em todos os momentos.

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A Antônio Carlos de Freitas também pelo apoio e incentivo.

Aos amigos e também alunos do laboratório de genética: Marcelo M.

Tavares, Luis G. B. Goes, Luciana S. Cabral, Gil R. H. Ribeiro, Rodrigo F.

Ramalho, Guilherme Francisco, Juliana S. Capitanio, Adriana M. Orimoto e

Daniela C. C. Santos.

Em especial a Olga Brunner pelo convívio desde o início, mesmo antes

de eu ser aluno do curso de mestrado.

Aos fúncionários e também amigos do laboratório de Genética do

Instituto Butantan; Zenaide L. Silva, Vera L. A. Rodrigues, Tânia R. Berulis,

Ivone S. dos Santos, Laerte P. do Santos, Ronaldo Dias, Helir Serralvo.

Aos funcionários da Pós-Graduação por toda ajuda dispensada.

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Índice

I - Introdução...................................................................................................01

II - Objetivos....................................................................................................18

III - Materiais e Métodos

1.Amostras.............................................................................................19

2.Extração de RNA................................................................................19

3. Obtenção de cDNAs por transcrição reversa.....................................20

4. Reação em Cadeia pela Polimerase -“Nested Multiplex PCR”.........21

4.1. Oligonucleotídeos Iniciadores (primers)..............................21

4.2. Reações.................................................................................23

4.3. Análise dos Produtos Amplificados......................................25

5. Reações de “Semi-Nested PCR” e “Nested-PCR".............................25

5.1. Oligonucleotídeos iniciadores..............................................25

5.2. Reações.................................................................................30

5.3. Análise dos Produtos Amplificados......................................32

6. Determinação da seqüência de nucleotídeos......................................32

6.1. Purificação dos Produtos de PCR.........................................33

6.2. Reação de determinação de Seqüências de nucleotídeos......33

7. Edição e Análise das Seqüências Obtidas..........................................35

8. Localização das diferenças na estrutura da hemaglutinina................35

9. Árvore genealógica............................................................................36

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IV - Resultados.................................................................................................37

1. Detecção, tipagem e subtipagem das amostras clínicas.....................37

2. Obtenção da região codificadora completa de HA1..........................40

3. Nested e Semi-nested PCR................................................................40

4. Seqüências de aminoácidos de HA1 das amostras estudadas:

análise comparativa das amostras entre si e com as cepas vacinais...42

4.1. Tipo A Subtipo H1N1...........................................................42

4.2. Tipo A Subtipo H3N2...........................................................49

4.3. Tipo B...................................................................................59

4.4. Pesquisa das seqüências de nucleotídeos no "Genbank"......63

4.5. Pesquisa no "Genbank" das seqüências de A H1N1.............64

4.6. Pesquisa no "Genbank" das seqüências de A H3N2.............65

4.7. Pesquisa no "Genbank" das seqüências de vírus do tipo B..66

4.8. Árvore Genealógica..............................................................66

V - Discussão...................................................................................................70

VI - Conclusão.................................................................................................81

VII - Resumo....................................................................................................82