Curva Padrão
Por: SonSolimar • 4/6/2018 • 1.217 Palavras (5 Páginas) • 351 Visualizações
...
Tubo
[Proteína] [pic 26]
Absorbância [pic 27]
B
0
0,288
1
10
0,134
2
20
0,183
3
50
0,227
4
70
0,236
5
100
0,240
6
150
0,245
D
89
0,311
A curva padrão, obtida a partir da relação entre a concentração de proteína das amostras e das medidas de absorbância, está definida na Figura 1. Para a construção da curva foram utilizadas apenas as medidas de , 2 e , pois apresentaram uma maior linearidade. As demais medidas foram descartadas por não apresentaram um crescimento proporcional, tal problema deve ter sido causado por algum erro no preparo das amostras.[pic 28][pic 29][pic 30]
[pic 31]
Figura 1. Curva padrão para quantificação de proteína de albumina bovina pelo método de Bradford
Definição da Curva Padrão
Para determinar a equação da curva padrão foi utilizada uma técnica de regressão linear conhecida como Método dos Mínimos Quadrados. Essa técnica estabelece uma equação de primeiro grau que visa minimizar a diferença entre os valores estimados a partir da equação e os valores observados (valores reais). Para determinar os valores de e na equação, serão utilizados os dados apresentador na tabela a seguir.[pic 32][pic 33][pic 34]
Tabela 4. Relação de valores utilizados para determinar a equação da curva padrão
Medida
[pic 35]
[pic 36]
[pic 37]
[pic 38]
1
10
0,134
1,34
100
2
20
0,183
3,66
400
3
50
0,227
11,35
2500
SOMA
80
0,544
16,35
3000
MÉDIA
26,667
0,1813
-
-
Para determinar o coeficiente , temos[pic 39]
[pic 40]
Para determinar o coeficiente , temos[pic 41]
[pic 42]
Desse modo, temos para a curva padrão a seguinte equação
[pic 43]
Concentração da amostra desconhecida
Para determinar a concentração da amostra basta utilizar a equação obtida a partir da regressão linear. Nesse caso, a variável irá representar a concentração de proteínas [P] e a variável irá representar a absorbância A. Assim, temos[pic 44][pic 45]
[pic 46]
[pic 47]
---------------------------------------------------------------
Discussão
Durante o experimento foi possível verificar alguns fenômenos:
Existe uma correlação direta entre a concentração de proteína e a medida de absorbância.
Esse fenômeno pode ser explicado a partir utilização da técnica de Bradford, que utiliza o corante Azul Brilhante de Coomassie G-250. Esse corante apresenta três formas: a forma catiônica, de cor vermelha; a forma neutra, de cor verde; e a forma aniônica, de cor azul. Em condições ácidas, a coloração predominante é a vermelha, onde apresenta uma Absorbância máxima de . Contudo, quando o corante se liga em proteínas, mais especificamente aos resíduos de aminoácidos carregados positivamente (Lisina, Arginina e Histidina), ele se converte em uma forma não protonada e assume a cor azul, com uma Absorbância máxima de . [pic 48][pic 49]
As interações iônicas e interações hidrofóbicas estabilizam a forma aniônica do corante. Desse modo, o número de ligações é aproximadamente proporcional ao número de cargas positivas encontradas na proteína e, consequentemente, ao número de moléculas da mesma. Esse fenômeno pode ser verificado visualmente pela coloração das amostras que apresentaram uma variação na intensidade do azul. As amostras variaram desde uma coloração azul menos intensa, para amostras com menor concentração de proteína, até uma coloração azul mais intensa, para as amostras com maior concentração de proteína.
Algumas medidas não apresentaram um crescimento proporcional
A sensibilidade do reagente deveria apresentar saturação apenas na amostra de
...