Cromatografia - IMAQ

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Para cada proteína específica podemos padronizar um tipo de método de separação ou purificação, e um íon quelato específico.

4. METODOLOGIA

A purificação das proteínas recombinantes foi realizada através da lise pela adição de 10 ml de tampão de lise (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol, pH 8,0) juntamente com 20 µl de lisozima (50 mg/ml), sendo a amostra sonicada em 10 ciclos de 30 segundos na potência de 12 W, com 30 segundos de intervalo em banho de gelo. Após a sonicação, foram adicionados 75 µl de RNAse. O material lisado foi centrifugado a 4ºC por 30 minutos a 12.000 x g e o sobrenadante imobilizado em 600 µl do suporte Ni-NTA agarose (Qiagen, Dusseldorf), conforme instruções do fabricante. Foram realizadas as lavagens do suporte e eluição da proteína utilizando-se o tampão de lavagem (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 20 mM de Imidazol, pH 8,0) e o tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 250 mM de Imidazol, pH 8,0). O suporte foi lavado três vezes com 10 ml do tampão de lavagem e a proteína liberada em cinco etapas de adição de 600 µl do tampão de eluição. Para a diminuição da concentração de sais, as eluições foram dialisadas duas vezes a 4ºC em tampão de diálise (50 mM NaH2PO4, 150mM de NaCl, pH 8,0).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A purificação de proteínas por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) necessita de algumas etapas anteriores, que se utilizam das técnicas de DNA recombinante, no caso a expressão heteróloga de proteínas, por exemplo.

A expressão heteróloga de proteínas consiste na amplificação de um gene específico, que codifique uma proteína específica, que é amplificado e clonado em um sistema eucarioto recombinante, como bactérias por exemplo.

A sequência de bases que codificará esta proteína que se quer clonar e posteriormente purificar, é inserida em um plasmídeo (molécula de DNA circular encontrado em bactérias), este plasmídeo é inserido em uma bactéria que irá cloná-lo juntamente com seu DNA, e o mesmo processo é repetido para a expressão da proteína. A retirada da sequência do vetor de clonagem e sua inserção no vetor de expressão se dá através de enzimas de restrição e ligação, respectivamente. Porém quando retirarmos a sequência do vetor de expressão, iremos retirar também uma sequência que codifica a produção do aminoácido histidina, que irá conferir a tag de histidina para possibilitar a purificação.

A cultura de bactérias contendo a proteína recombinante de interesse foi submetida a um processo de crescimento em temperatura adequada, posteriormente se realizou uma centrifugação que gerou um pellet contendo as bactérias com a proteína recombinante de interesse. Este homogenato de células bacterianas foi submetido à purificação em colunas específicas.

As colunas utilizadas foram colunas comerciais, NI- NTA Agarose, na Qiagen. Estas colunas possuem uma resina de agarose e níquel, quando este homogenato de células foi submetido a passagem pela coluna, as proteínas recombinantes, possuindo a cauda de histidina, ficaram retidas, pois o níquel tem afinidade com a tag de histidina, o que fará com que somente esta proteína de interesse fique retida na coluna, foram realizadas lavagens para eliminar todas as outras proteínas que não são de interesse para a purificação, e por fim a proteína foi eluída, ou seja, foi uma solução contendo sais específicos, que ocuparam o sítio de ligação com o níquel, liberando assim a proteína purificada.

Ainda para se ter certeza da proteína purificada, foram realizados outros testes, como um gel de poliacrilamida e western blot, que, sabendo-se o tamanho da proteína e tendo anticorpos específicos para a cauda his-tag, pode-se confirmar a purificação.

Podemos observar estes resultados obtidos nas figuras 1 e 2 a seguir.

[pic 2][pic 3]

Figura 1. Gel de Poliacrilamida SDS-PAGE, realizado no Laboratório de Protozoologia (UFSC), com o objetivo de verificar a eficiência da purificação da Tripanotiona redutase. E1: Primeira Eluição; E2: Segunda Eluição; E3: Terceira Eluição; E4: Quarta Eluição; E5: Quinta Eluição; C+: Controle positivo AK (Arginia quinase).Figura 2. Revelação do Western Blot confirmando a proteína purificada.

Através das informações conhecidas, e olhando as figuras anteriores conseguimos ter a certeza de que a proteína purificada foi sim a proteína que se estava esperando, por todos os motivos já citados, tamanho, cauda de histidina.

Podemos também analisar a importância destes estudos de proteínas específicas, sua importância é muito grande dentro da área da saúde por exemplo, para desenvolvimento de novas formas de diagnósticos ou diagnósticos mais específicos para determinadas doenças e também para o desenvolvimento de fármacos. Pois há muitas proteínas ainda, de vários organismos ou patógenos que ainda não foram caracterizadas, ou seja, não sabemos nada sobre elas, são as chamadas proteínas hipotéticas, sabe-se através de uma sequência de nucleotídeos, que elas são produzidas, mas não se sabe ainda qual sua função específica, e estes estudos podem nos mostrar isso, a purificação já é uma porta para esta caracterização.

6. CONCLUSÕES

Através da pesquisa bibliográfica e da parte prática realizada podemos entender a importância desta técnica para a saúde pública, por exemplo.

REFERÊNCIAS

BERGDOLL, M.S.;