CONSTRUÇÃO DE UMA RETA - PADRÃO DE PROTEÍNAS

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O coeficiente de extinção E, é uma característica de cada substância e depende também do solvente em que está dissolvido, da temperatura e do comprimento de onda utilizado. Devido a sua grande especificidade, por vezes, não é possível verificar os valores tablados para esta grandeza, o que impede de utilizar a lei de Lambert-Beer diretamente para obter a concentração da sustância. Por conseguinte recorremos a elaboração de uma reta-padrão, o objetivo desta atividade prática. Esta reta vai representar vai representar a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de absorvância obtidos de soluções -padrão da proteína em estudo. O gráfico resultante terá no eixo das ordenadas os valores de Absorvância obtidos e no eixo das abcissas a concentração. O declive desta reta corresponde à constante de proporcionalidade.

Outro objetivo desta atividade laboratorial foi verificar que a absorvância de uma solução é diretamente proporcional à concentração do soluto, segundo a Lei de Lambert-Beer. É de salientar que a absorvância é tanto maior quanto maior for a distância percorrida, no nosso caso a distância percorrida foi igual a 1 cm.

Para calibrar (zerar) o espectrofotómetro foi necessário utilizar uma solução ausente de proteína (variável dependente em estudo) que se designa de branco. Esta solução contém apenas reagente de Bradford e água destilada.

Procedemos apenas à realização de um branco aquando do momento inicial visto que o comprimento de onda utilizado foi o mesmo para todas as soluções.

Para melhorar significativamente os resultados seria favorável fazer um mínimo de 8 soluções-padrão, no entanto por nós foram apenas elaboradas 4 soluções-padrão (todas com concentrações de proteína BSA diferentes). Estas soluções foram preparadas com micropipetas o que permitiu o rigor das suas preparações. Os reagentes utilizados foram: água destilada, corante azul de Comassie e proteína BSA.

Como referido no relatório anterior o corante de Azul de Comassie forma complexos com a proteína BSA em solução, apresentando uma cor acastanhada. Esta propriedade explica o degradê que se verificou nas diferentes soluções-padrão, como podemos verificar na imagem que se encontra nos resultados. Uma maior concentração de proteína BSA em solução permite também a formação de uma quantidade maior de complexos que se foram entre a proteína e o corante. Podemos concluir portanto que quanto maior for a quantidade de proteína em solução, mais aparente será a coloração azulada da solução.

No que toca à utilização do uso do espectrofotómetro, devemos ter alguns cuidados para assim evitar o máximo de erros de leitura que começa na calibração deste seguindo as instruções recomendadas, na certificação se o equipamento está fechado ou não aquando da leitura, pois a luz ambiente interfere com os resultados.

Com base nos dados obtidos na atividade laboratorial anterior, constatamos que o comprimento de onda ideal para a substância analisada (BSA) é de 595nm, por esta razão, este foi o valor escolhido nesta experiência.

Medimos então a absorvância, no espectrofotómetro, para cada solução padrão. Com os resultados obtidos contruímos a reta-padrão para a proteína BSA: 21,758x + 0,2272 em que 21,758 é o declive da reta e portanto a contante de proporcionalidade da proteína BSA. É importante referir que teoricamente esta reta devia passar na origem uma vez que utilizámos o branco como solução-padrão. Possivelmente, devido as condições em que ocorreram a preparação das soluções poderia haver erros de leitura uma vez que o espetrofotómetro é bastante sensível.

Através da reta-padrão obtida obtivemos também o coeficiente de correlação: 0,9131. O coeficiente de correlação permite-nos verificar se o modelo utilizado é eficaz ou não e deve variar entre 0 e 1. Com base nos nossos resultados verificamos que o modelo da nossa reta-padrão consegue traduzir eficazmente os resultados obtidos.

Podemos concluir que o objetivo desta atividade prática foi bem sucedido uma vez que o coeficiente de correlação foi próximo de 1.

Este trabalho permitiu também a familiarização com a técnica da espectrofotometria e um dos métodos colorimétricos mais utilizados –o método de Bradford.