Relatório Modelo Vírus em Planta

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 

RELATÓRIO REFERENTE A AULA PRÁTICA:

TRANSMISSÃO VÍRUS MODELO PLANTA

VIROLOGIA GERAL 2024.2

Relatório da aula prática  apresentado   à   disciplina Virologia geral, fornecida pelo curso de  bacharelado   em  Ciências  Biológicas:  Microbiologia e Imunologia, no Instituto de Microbiologia  Paulo de  Góes da   Universidade Federal do Rio de Janeiro. 

                                                          Rio de Janeiro, RJ

2024

1. INTRODUÇÃO

O vírus do mosaico do tabaco (TMV) foi o primeiro vírus vegetal  identificado e o primeiro vírus descoberto pelo ser humano, no final do século XIX; ele afeta diversas plantas de fumo, como da família Solanaceae, principalmente da espécie Nicotiana tabacum, planta do tabaco. A transmissão do vírus ocorre de forma mecânica, de uma planta para outra ou pelo contato direto de agricultores.

O próprio homem desempenha um papel central nesse processo, atuando como principal transmissor especialmente durante o manejo ou durante os tratos culturais. Um dos sintomas da infecção desse vírus RNA (+) são os padrões e manchas de descoloração ocasionadas por danos na produção de clorofila.

Esse vírus é de grande importância econômica pois afeta diversos produtores, danificando suas plantações. A Nicotiana tabacum é uma planta herbácea perene encontrada em todos os continentes, exceto Antártica, principalmente na América do Sul e Central.

No experimento foram utilizadas duas variedades cultivadas da espécie Nicotiana tabacum, a SR1 e Xanthi. A primeira mais suscetível a infecção pelo TMV e a segunda, mais resistente por desenvolver uma resposta de hipersensibilidade (HR), gerando uma lesão necrótica por um acúmulo de substâncias, como citocinas e etileno, que impede o espalhamento do vírus na folha e a nível sistêmico.

2. OBJETIVO

Observar a infecção pelo TMV (vírus do mosaico do tabaco) e sintomas característicos nas plantas infectadas, e verificar resistência e susceptibilidade de plantas Nicotiana tabacum CV. Xanthi e Nicotiana tabacum CV. SR1 ao vírus do mosaico do tabaco.

3. MATERIAIS 

•  Cadinho e pistilo
•  Folhas contaminada (1g) com o vírus (antes armazenadas no freezer -80 graus)
•  Abrasivo celite
•  Tampão fosfato

•  2 Plantas da espécie SR1 (MOCK e infectadas)
•  2 Plantas da espécie Xanthi (MOCK e infectadas)

4. MÉTODOS

4.1.  Maceração da Folha Infectada

O processo se iniciou com a separação do material necessário para a realização do experimento. Em seguida, em um cadinho foram adicionados cerca de 1g (quantidade imprecisa, visto que, a retirada foi dificultada pelo congelamento) de folha infectada, 9 mL de tampão fosfato. Com isso, iniciamos a maceração. A folha infectada, que foi utilizada, estava mantida em nitrogênio líquido a -80°.

4.2. Passagem do macerado infectado para folhas saudáveis

Na etapa seguinte, implementamos cuidadosamente o processo de inoculação, começando pela preparação do macerado e a diluição adequada. Inicialmente, realizamos uma diluição utilizando 1g de folha infectada com o vírus em 9 mL de tampão fosfato (1:10). Essa diluição foi essencial para atingir uma concentração apropriada do vírus, proporcionando condições ideais para a transmissão eficiente para as plantas saudáveis.

Para potencializar a entrada dos vírus nas células vegetais, aplicamos manualmente a celite nas folhas de cada planta demarcada após a diluição. A celite desempenha o papel de um abrasivo, contribuindo para criar microlesões na superfície foliar, favorecendo a infecção viral nessas plantas.

Em seguida, procedemos à aplicação do macerado de folha infectada. Utilizando uma pipeta, cuidadosamente aplicamos 100μl do macerado nas folhas preparadas previamente com o abrasivo. Esse processo foi realizado de forma mecânica, espalhando o macerado com os dedos e exercendo uma leve pressão na folha para garantir uma distribuição homogênea do vírus.

Esse protocolo resultou na infecção de duas folhas selecionadas de cada planta (SR1 e Xanthi).

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                        Figura 1: Grupos experimentais usados na prática: plantas Xanthi, Mock e infectada, e SR1, Mock e infectada.

4.3. Preparo da planta controle

Selecionamos uma planta de cada espécie para ser o MOCK, ou seja, sem a infecção do vírus. Foi adicionado o abrasivo em 3 folhas das duas espécies MOCK e em seguida realizamos a passagem de uma solução tampão, de forma cuidadosa nas folhas selecionadas.

4.4. Passagem do macerado não infectado para folhas saudáveis do MOCK

Nesta parte do processo, colocamos o abrasivo nas folhas das plantas mock  SR1 e Xanthi e em seguida, suavemente, passamos o macerado não infectado em cerca de 3 a 4 folhas e reservamos em um local com certa distância das plantas que foram infectadas, para que não houvesse contaminação. Ao final de todo o processo, molhou-se as plantas Mock, SR1 infectada e Xanthi infectada.

5.1. Resultado 1

        Após 3 dias da infecção, observou-se nas folhas da planta Xanthi resistentes lesões necróticas no formato de anéis por meio da resposta imune gerada, com a liberação de espécies reativas de oxigênio. Isso ocorre porque o sistema imunológico da planta detecta o capsídeo viral como um PAMP, e a resposta é ativada com sinalização em minutos, mas em aproximadamente 12 horas as células são induzidas à apoptose, liberando espécies reativas de oxigênio e formando essas lesões, como pode ser visto nas figuras abaixo.