Os Marcadores Moleculares

...

Tipo RAPD

O emprego de técnicas baseadas na amplificação enzimática de DNA tem grande apelo por não ser necessário conhecimento a priori das sequências que serão amplificadas. Esta variação foi desenhada para contornar o problema do conhecimento prévio da sequência de DNA que se deseja amplificar, possibilitando a utilização da técnica em organismos onde não existia nenhum conhecimento da sequência de DNA. O princípio da técnica em primeiro lugar é construir iniciadores (primer) com sequências arbitrárias, que satisfaçam algum critério com relação às suas propriedades de hibridação. O procedimento mais comum é que tenham 10 nucleotídeos e que pelo menos 6 deles sejam C ou G. Utiliza-se um único primer, de tal forma que, se houver duas seqüências que hibridizem com esse primer, dispostas de modo palindrômico a uma distância igual ou menor que 2Kb, haverá amplificação do fragmento interno. A metodologia utilizada no RAPD é semelhante à do PCR. A diferença é que no RAPD, como a sequência dos primers (iniciadores) é aleatória, qualquer DNA que estiver contaminando a reação poderá ser amplificado e assim obter um resultado variável, sendo necessário um controle rigoroso da pureza dos materiais e do DNA. O polimorfismo detectado em um loco RAPD refere-se, em última análise, a mutações que ocorrem na fita de DNA impedindo o anelamento do primer a intervalos de fita que permitam a amplificação do segmento pela polimerase, inserções ou deleções de sequências.

Tipo SCAR e STS

Marcadores SCAR e STS são amplificados com iniciadores específicos, desenvolvidos com base em seqüências já mapeadas ou caracterizadas. Muitos desses iniciadores são obtidos da conversão de marcadores RAPD e RFLP em SCAR e STS, respectivamente. As técnicas de SCAR e STS são muito similares e as diferenças entre elas é muito tênue, pois o SCAR pode amplificar regiões de DNA que contenham sequências repetitivas e o STS amplifica DNA de cópia simples. SCAR surgiu como uma variação de STS e foi assim denominada pela conversão de marcadores de RAPD em SCAR. Tipo microsatélites ou SSR. Esta técnica baseia-se no uso de dois pares de iniciadores e da reação de PCR para detectar variações em locos de sequências repetitivas. Sequências repetitivas simples são sequências de nucleotídeos (um, dois, três ou quatro nucleotídeos). A técnica consiste de uma seleção de clones que contêm a repetição usando sondas sintéticas complementares à repetição que se deseja e purificam-se os clones selecionados. Em seguida, os clones são seqüenciados e iniciadores específicos são construídos. Por fim, os iniciadores são testados para checar se são realmente informativos. Em geral, somente cerca de 10 a 20% dos iniciadores são informativos, tornando essa técnica de custo elevado e de intenso trabalho. Além de que os géis para resolver os fragmentos de DNA devem ser de policrilamida. Elevando mais ainda o custo. O polimorfismo é revelado em um loco devido a diferenças no número de vezes em que um dinucleotídeo se repete naquele loco. Estas variações no número de repetições constituem-se, em última análise, em variaçõesno comprimento do segmento.

Tipo AFLP

Esta técnica consiste na combinação do RFLP e do PCR. A técnica envolve a digestão de DNA comenzima de restrição, conforme requer uma análise de RFLP e a amplificação de segmentos do DNA do PCR. Essa técnica permite que fragmentos anônimos do genoma sejam amplificados por PCR após terem sido originados pela digestão do genoma por enzimas de restrição. Essa técnica envolve as seguintes etapas: digestão do genoma por uma enzima de restrição; ligação de adaptadores aos fragmentos gerados; amplificação dos fragmentos a partir de iniciadores que hibridizam com os adaptadores. Como as sequências que existem nos adaptadores são escolhidas arbitrariamente, a grande vantagem desse método é que as condições de amplificação são ótimas de acordo com parâmetros determinados livremente pelo pesquisador. Um grande número de locos pode ser amostrado em um único gel AFLP. O número médio de locos polimórficos também é alto nestas amostras. O polimorfismo obtido com AFLP está baseado em diferenças entre genótipos na distribuição dos sítios de restrição e na amplificação diferencial de fragmentos.

APLICAÇÃO

Marcadores moleculares revelados por hibridização

Tipo RFLP

Essa técnica possui uma excelente reprodutibilidade nos resultados, ou seja, o padrão de fragmentos produzidos por uma determinada enzima de restrição para um dado DNA deve ser mantido e permanecer constante quando a digestão é refeita. A desvantagem desta técnica se deve ao seu custo relativamente alto, além de ter revelado um grau de polimorfismo de intermediário a baixo, conforme a espécie. Outra desvantagem é o fato de ela ser mais demorada que as outras para a obtenção de resultados se o método de visualização for o do filme de Raio X. O tempo para obter os resultados pode variar de 7 a 21 dias, conforme o tempo necessário para expor o filme de raio X à membrana de nitrocelulose. Os pesquisadores têm utilizado esta técnica para investigar a variabilidade genética a partir do DNA de cloroplastos, para análises do DNA ribossomal 16S das bactérias, para identificação e detecção de fungos fitopatogênicos e de maneira geral e de fitobactérias. Tipo minisatélites ou locos VNTR Pode ser utilizada como método de identificação e detecção de fungos fitopatogênicos e análise de variação genética, entre outras. Esta técnica apresenta as vantagens e desvantagens da técnica de RFLP, com a vantagem adicional da variação na distribuição dos sítios de restrição, das sondas utilizadas, e do número e tipos de sequências repetitivas.

Marcadores moleculares revelados por amplificação

Tipo PCR

A alta sensibilidade aliada à especificidade e rapidez fazem esta técnica como poderosa ferramenta para auxiliar os pesquisadores na detecção de vírus e viróides em plantas, além do estudo e entendimento da relação vírus-vetor e no transporte de vírus célula a célula, permitindo o desenvolvimento de técnicas para controle das viroses e para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência. Esta técnica também é utilizada para detecção de DNA de adenovírus em linfócitos humanos, estimativa de frequência alélica, caracterização gênica, detecção de vírus de plantas,