Avaliação da eficiência de diferentes técnicas de concentração enzimática

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As poligalacturonases são as enzimas pectinolíticas que catalisam a clivagem hidrolítica da cadeia de ácido poligalacturônico (ROMBOUTS e PILNIK, 1980).

Estas enzimas podem ser produzidas por via biotecnológica (uso de microrganismos), porém o processo é influenciado pelas condições de cultivo, fermentação submersa ou sólida (DIAS,2016)

Alguns micro-organismos possuem muitos genes codificados de poligalacturonases. Em Aspergillus niger, por exemplo, há uma família completa de genes que produzem várias isoenzimas com consideráveis diferenças em relação à especificidade por substrato, ao padrão de clivagem e quanto ao pH ótimo de atividade (LANG e DÖRNENBURG, 2000).

A maior parte dos micro-organismos pectinolíticos produz um complexo de enzimas pectinolíticas. Fungos são geralmente usados como fonte das preparações comerciais (FAWOLE e ODUNFA, 2003). Na maioria dos casos o fungo Aspergillus niger é utilizado para produção industrial, já que é classificado como GRAS (generally recognized as safe) pelo Food and Drug Administration (FDA), órgão do governo dos Estados Unidos responsável pelo controle de alimentos e medicamentos. Entretanto, as pesquisas com o gênero Penicillium sp. tem demonstrado que alguns isolados são Introdução produtores promissores de pectinases (BARACAT et al.,1989; FERNANDES-SALOMÃO et al., 1996).

O processo de separação e purificação de bioprodutos é um segmento muito importante na indústria, pois pode chegar a representar de 80 a 90% do custo de produção. Portanto, o desenvolvimento de um processo eficiente e de baixo custo é de extrema relevância (BELTER, CUSSLER e HU, 1988).

Após a fermentação, dependendo da sua aplicação, são necessárias operações de purificação da enzima, que devem ser incluídas no custo final do produto. Quanto mais alta a pureza necessária a uma dada proteína, mais custoso é o processo de purificação (MORAES e KALIL, 2009).

Geralmente, a otimização de um protocolo de purificação envolve muita experimentação do tipo tentativa e erro, especialmente pelo fato de que, mesmo quando se conhecem as características físico-químicas da proteína a ser purificada, muitas vezes é imprevisível o seu comportamento no decorrer do processo de purificação. O grande desafio destes processos é o trabalho para se encontrar as melhores estratégias e, se for o caso, adequar a metodologia para a escala de produção pretendida, garantindo que o produto final tenha todas as características necessárias para a sua aplicação (ALMEIDA e KURTENBACH, 2002).

Precipitantes que não desnaturam produtos biológicos (ex.: enzimas), também podem ser usados, sendo o precipitado formado geralmente mais estável do que o material solúvel (CORTEZ e PESSOA JR., 1999; GOLUNSKI et al., 2011; SOARES et al., 2012).

Os processos de precipitação com sais, como o sulfato de amônio, solventes e polímeros não-iônicos são bastante utilizados em operações de concentração e pré-purificação de proteínas. No entanto, a elevação da força iônica do meio com a adição de altas concentrações salina se o emprego de solventes orgânicos podem provocar a perda de atividade enzimática e suas adequações devem ser verificadas experimentalmente (ZHANG et al., 2004).

O álcool polivinílico (PVA) e o polietilenoglicol (PEG) são polímeros não-iônicos, solúveis em água; o PVA tem sido muito estudado em sistemas coloidais, sendo biodegradável com bactérias Pseudomonas, enquanto que o PEG tem sido utilizado como agente precipitante de proteínas do plasma, por exemplo fibrinogênio, pela sua possibilidade de variações de peso molecular, neutralidade e solubilidade em água (NAVA et al., 2005).

O álcool polivinílico (PVA) é conhecido por sua ampla escala de aplicações nos campos industriais, farmacêuticos, entre outros (KUMAR et al, 2004). Entre as principais características do PVA pode-se citar sua não toxicidade, excelente capacidade de formação de filmes por deposição à temperatura ambiente, baixo custo e disponibilidade (ARANHA e LUCAS, 2001). O PVA também é utilizado como hidrogéis por exibir um alto nível de absorção de água ou líquidos biológicos. Por causa destas propriedades, o PVA é capaz de simular o tecido natural e encontra numerosas aplicações na engenharia (LI e NEOH, 2004).

O polietilenoglicol (PEG) é um polímero formado a partir do etileno glicol (SHAH, et al, 2008). Uma característica importante do PEG é a sua capacidade de reduzir ou evitar a adsorção de proteínas e bactérias sobre diversos tipos de superfícies (KONO et al, 2008). Este polímero pode ser usado em aplicações anticépticas, devido a sua não toxicidade. Assim sendo, o PEG pode evitar a formação de biofilmes sobre superfícies e sob este aspecto foi estudada a inserção de PEG em filmes poliméricos (PASCHE et al., 2005).

A precipitação de proteínas por adição de solventes orgânicos é um processo que envolve principalmente a redução da constante dielétrica do meio, o qual promove a agregação de proteínas por interação de cargas. A desvantagem do uso deste método é a possível desnaturação das proteínas. Ainda assim, isto pode ser minimizado através da redução da temperatura para valores geralmente em torno de 0°C, já que, a baixa temperatura a flexibilidade das biomoléculas é menor, diminuindo assim a capacidade de penetração do solvente e de qualquer desnaturação irreversível das enzimas (PESSOA e KILIKIAN, 2005).

Os solventes adequados para precipitação de proteínas são aqueles miscíveis em água em todas as proporções e não tóxicos; os solventes mais usados que cumprem esses requerimentos são a acetona e o etanol (CUTLER, 2004), sendo este último o solvente mais popular e amplamente produzido no Brasil e no mundo.

A adição de altas concentrações de sal a uma solução proteica geralmente causa precipitação. Isto acontece por deslocamento das moléculas de água das porções hidrofóbicas na superfície das proteínas pelos íons do sal (solvatação). Deste modo, a solubilidade da proteína gradativamente se reduz à medida que suas porções hidrofóbicas interagem facilmente entre si e formam agregados entre diferentes moléculas proteicas até precipitar (salting-out). Consequentemente, as proteínas maiores ou com maiores regiões hidrofóbicas irão geralmente se agregar e precipitar a concentrações salinas baixas (CUTLER, 2004; MORAES, PIRES E CASTILHO, 2008).

Durante a purificação, é aconselhável a escolha de técnicas que explorem sequencialmente diferentes propriedades físico-químicas das proteínas (PESSOA-JÚNIOR e KILIKIAN,