Seleção de BAL autóctones do leite caprino com características probióticas

...

2.3. Atividade de agregação

2.3.1 Autoagregação e Coagregação

O procedimento foi conforme descrito por Kos et al. (2003). Para o teste de autoagregação, 4 mL da suspensão celular contendo 108 UFC/mL foram homogeneizadas em vortex por 10 segundos e incubados a 37 °C. Foram retiradas alíquotas de 5 μL nos tempos de 1, 2, 3, 4 e 5 horas, transferidas para microplaca contendo 195 μL de PBS pH 7,2 e lida as absorbâncias a 620 nm. Para calcular a porcentagem de autoagregação, foi utilizada a seguinte equação: 1-(A0/At) x 100, onde At representa a absorbância nos tempos: 1, 2, 3, 4 e 5 horas e A0 a absorbância no tempo zero. No teste de coagregação, a metodologia empregada para a suspensão celular foi a mesma do teste de autoagregação. Para o teste, os agentes patogénicos utilizados foram: Salmonella typhi (ATCC 6539) e L. monocytogenes (ATCC 7644). Os micro-organismos foram testados em pares (2 mL de suspensão celular, sendo patógeno e BAL). E foi realizado um grupo controle contendo os microrganismos separados, para calcular a porcentagem de coagregação.

2.4. BSH, β-galactosidase e a atividade de descarboxilase

A atividade da enzima Hidrolase de Sais Biliares (BSH) das culturas selecionadas com melhores resultados nos testes descritos anteriormente foi detectada (ZAGO et al., 2011). A presença de halos em torno de colônias ou colônias brancas opacas indicavam atividade BSH. O inoculo de cada estirpe em MRS sem suplementação foi incluído como controle negativo. A atividade β-galactosidase das estirpes selecionadas foi avaliada empregando discos de papel de filtro estéril impregnados com O-nitrofenil-β-d-galactopyranose (ONPG, Fluka, Buchs, Suíça), de acordo com as instruções do fabricante. A observação de um composto cromogênico amarelo, O-nitrofenol, indicava colônia positiva. A atividade da enzima descarboxilase foi realizada segundo Komprda et al. (2004), a mistura foi revestida com óleo de parafina estéril, as cores violeta e amarelo foram consideradas positivo e negativo, respectivamente, após 1, 4, 24 e 48 h a 37 °C.

3. Resultados e Discussão

3.1. Simulação a tolerância no TGI

Todos os isolados apresentaram resistência à bile, apresentando taxa de sobrevivência superior a 90%. Estes resultados estão de acordo com os encontrados por Fernandez et al. (2003) com concentrações de bile de 0,15% e Maragkoudakis et al. (2006) com concentrações de 0,30%. A resistência ao suco biliar é um fator importante para possíveis candidatas a probiótico (SOLIERI et al., 2014). Em resposta ao suco pancreático, quase todos os isolados UNIVASF CAP apresentaram taxa de sobrevivência superior a 90%, estes resultados demostram habilidade natural para tolerar esse composto. Os isolados UNIVASF CAP apresentaram em sua maioria sobrevivência acima de 90% (Tabela 1), mostrando que o suco intestinal não foi barreira para o crescimento em condições de simulação in vitro do TGI, estes resultados são semelhantes aos encontrados por Bao et al. (2010) que observou alta sobrevivência ao suco intestinal. Os isolados UNIVASF CAP 16 e 279 apresentaram maior sobrevivência ao TGI, demostrando propriedades requeridas para bactérias produtoras de ácido láctico e sua sobrevivência no intestino delgado.

Tabela 1. Taxa de sobrevivência dos isolados submetidos aos testes de tolerância ao TGI.

Taxa de Sobrevivência (%)

N° dos isolados sobreviventes

Bile

Suco pancreático

Suco intestinal

100 ≥ % ≥ 90

58

57

56

89 ≥ % ≥ 80

0

1

1

79 ≥% ≥ 70

0

-

1

69 ≥ % ≥ 60

0

-

-

3.2. Atividade de agregação

3.2.1 Autoagregação e Coagregação

A capacidade autoagregativa dos isolados UNIVASF CAP variou entre 3,58-36,65%, aumentando ao longo do tempo (Tabela 1). O isolado UNIVASF CAP 84 apresentou a maior capacidade autoagregativa de 36,65%. De acordo com Del Re et al. (2000), estirpes com valores acima de 10% são naturalmente autoagregantes. A autoagregação tem sido correlacionada com a adesão, que é conhecido por ser um pré-requisito importante para o desencadeamento da infecção por vários agentes patogênicos no TGI, nesse sentido bactérias probióticas promovem ação benéfica por exclusão competitiva.

Tabela 1 - Percentagem média de atividade autoagregativa dos 58 isolados UNIVASF CAP ao longo do tempo 4 h.

Tempo (h)

UNIVASF CAP 1

Autoagregação (%)

1

12,50a

2

17,43b

3

21,66c

4

22,59d

Média

18,55

Equação

3,45x + 9,92

R2 = 0,9320

Para cada coluna, os valores médios com letras diferentes são significativos (P 1erro padrão (SE): 0,20.

Em geral, os isolados mostraram percentagem média coagregativa baixa (Salmonella typhi. De acordo com Solieri et al. (2014), valores inferiores a 20% são indicativos da capacidade coagregativa fraca. Sabe-se que a coagregação permite melhor ação antimicrobiana