Questões gerais para assimilação de conceitos

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NADH e NAD+ são, respectivamente, as formas reduzidas e oxidada da coenzima NAD. Em contraste com aquelas do NAD+, soluções de NADH absorvem luz em 340nm. Esta propriedade é empregada na determinação da concentração de NADH em solução, pela medida em um espectrofotômetro da quantidade de luz absorvida em 340nm pela solução. Explique como essas propriedades do NADH podem ser usadas para a montagem de um ensaio quantitativo da desidrogenase láctica.

[S](M) Vo (μM/min)

2,5 x 10-6 28

4,0 x 10-6 40

1 x 10-5 70

2 x 10-5 95

4 x 10-5 112

1 x 10-4 128

2 x 10-3 139

1 x 10-2 140

- Determinação aproximada de Vmáx e de Km por inspeção – Embora existam métodos gráficos para a determinação acurada dos valores de Vmáx e de Km de uma reação catalisada enzimaticamente, esses valores podem ser determinados rapidamente a partir das velocidades iniciais obtidas em concentrações crescentes do substrato. Usando as definições de Km e Vmáx estime os valores aproximados destas constantes para a reação enzimática que fornece os seguintes resultados:

[S](mM) Produtor formado (μmol/min)

1,5 0,21

2,0 0,24

3,0 0,28

4,0 0,33

8,0 0,40

16,0 0,45

- Análise gráfica dos valores de Vmáx e Km – Os dados experimentais abaixo foram coletados durante um estudo da atividade catalítica de uma peptidase intestinal capaz de hidrolisar o peptídio glicilglicina:

Glicilglicina + H2O → 2 glicina

A partir destes dados determine, por análise gráfica (veja Adendo 8-1-Lehninger), os valores de Km e de Vmáx para esta preparação de enzima e seu substrato.

- Proteção de uma enzima contra a desnaturação pelo calor – Quando uma solução de enzima é aquecida, ocorre uma progressiva perda da atividade catalítica com o tempo. Esta inativação é o resultado do desenovelamento da molécula da enzima nativa para uma conformação enrolada ao acaso, devido ao aumento da energia térmica das moléculas de enzima. Uma solução de hexoquinase incubada a 45ºC perde 50% de sua atividade em 12min, mas quando a hexoquinase é incubada a 45ºC na presença de grandes concentrações de um dos substratos, ela perde apenas 3% de sua atividade após o mesmo período de tempo. Explique porque a desnaturação da hexoquinase é retardada na presença de um dos seus substratos.[pic 3]

- Inibição da anidrase carbônica pela acetazolamida – A anidrase carbônica é fortemente inibida pela droga acetazolamida, ela é empregada também para aumentar a secreção de urina e para tratar o glaucoma, doença caracterizada pela pressão excessivamente alta no interior do globo ocular. Nestes e em outros processos secretórios a anidrase carbônica desempenha um importante papel, já que ela participa na regulação do conteúdo de bicarbonato e o pH de muitos fluidos do corpo. A figura ao lado ilustra a variação da velocidade de reação em função da concentração de substrato para a reação catalisada pela anidrase carbônica. Quando o experimento é repetido na presença de acetazolamida, obtém-se a curva de baixo. Da inspeção das duas curvas e do seu conhecimento das propriedades cinéticas sobre inibidores competitivos e não competitivos, determine a natureza da inibição provocada pela acetazolamida. Explique.[pic 4]

- O pH ótimo da lisozima – A atividade enzimática da lisozima tem um valor ótimo em pH 5,2.

O sítio ativo da lisozima contém dois aminoácidos essenciais para a catálise: Glu35 e Asp52. Os valores de pKa das carboxilas das cadeias laterais desses dois resíduos são, respectivamente, 5,9 e 4,5. Qual o estado de ionização (protonado ou não protonado) de cada um desses resíduos no pH ótimo da lisozima? Como os estados de ionização destes dois resíduos de aminoácidos podem explicar o perfil de atividade (mostrado acima) da lisozima em função do pH?

- Trabalho de detetive. No livro de Agatha Christie Assassinato no Expresso do Oriente, a tarefa de Hercule Poirot como detetive era complexa, pela presença de tantos suspeitos plausíveis. Do mesmo modo, o mecanismo catalítico da carboxipeptidase A foi difícil de deslindar, por causa da presença de vários possíveis grupamentos catalíticos no centro ativo. Por exemplo, a hidroxila da tirosina 248 foi postulada como sendo o doador do próton para o grupamento NH do substrato, na etapa de clivagem. Planeje uma experiência que teste criticamente esta hipótese.

- Destruindo o cavalo de Tróia. A penicilina é hidrolisada e, portanto, tornada inativa pela penicilinase (também conhecida como β-lactamase), uma enzima presente em algumas bactérias resistentes. A massa desta enzima no Staphylococcus aureus é de 29,6 kd. A quantidade de penicilina hidrolisada em 1 minuto, em 10 ml de uma solução contendo 10-9 g de penicilinase purificada, foi medida em função da concentração da penicilina. Suponha que a concentração de penicilina não varie apreciavelmente durante o ensaio.

Quantidade hidrolisada

[Penicilina] (nanomoles)

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1 0,11

3 0,25

5 0,34

10 0,45

- 0,58

50 0,61

- Ponha em gráfico 1/V versus 1/[S] para estes dados. A penicilina parece obedecer à cinética de Michaelis-Menten? Se for o caso, qual é o valor de KM?

- Qual é o valor de Vmáx?

- Modo de inibição. A cinética de uma enzima é medida em função da concentração do substrato, na presença e na ausência de inibidor [I] 2nM.

Velocidade (μmoles/min)

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