Isolamento, Seleção e Determinação da Atividade Enzimática de Microrganismos Proteolíticos

...

As proteases de origem microbiana representam 40% do total de proteases comercializadas. Dentre as bactérias, o gênero Bacillus é o mais estudado quanto à sua produção, especialmente a subtilisina de B. subtilis. Já os fungos, de maneira geral são capazes de produzir a maior variedade de proteases entre os microrganismos. Além disso, as proteases de origem microbiana são compatíveis com políticas ambientais que promovem a sustentabilidade, uma vez que são produzidas a partir de fontes renováveis e são totalmente biodegradáveis. As enzimas microbianas também podem ser produzidas utilizando meios de cultura adequados (GUPTA & RAMMANI, 2006; WISEMAN, 2001).

Para o cultivo de microrganismo que sejam capazes de sintetizar essas enzimas, é necessário um meio nutricional que contenha em sua composição os nutrientes essenciais para seu crescimento. A primeira etapa para o cultivo consiste na identificação e aquisição do microrganismo produtor, sendo que esses microrganismos produtores podem ser selecionados a partir de diversas amostras como solo, ar, água, frutas em decomposição e tecidos vegetais. Diversas técnicas da microbiologia como o crescimento em placas de Petri, crescimento de tubo inclinado e técnicas de esgotamento para isolamento dos microrganismos são utilizadas e são essenciais para produção de qualquer produto biotecnológico (BOM & FERRARA & CORVO, 2008; TORTORA & FUNKE, 2008).

O crescimento destes microrganismos é otimizado quando inoculados em meios de cultura apropriados e mantidos em condições adequadas. As técnicas empregadas para o isolamento e cultivo de microrganismos dependem da fonte (alimentos, tecidos vivos, água, ar, etc.) e do tipo de microrganismo que se deseja isolar (enteropatógenos, bactérias lácticas, fungos filamentosos, leveduras, etc.). Isolar um microrganismo significa separara-lo a partir de uma população que o contém, desde que, como na maioria dos casos, os microrganismos façam parte de uma população mista. O isolamento de cultura pode ser feito diretamente a partir de uma amostra ou quando os microrganismos estão numa proporção adequada. Quando o microrganismo que se deseja isolar se encontra em pequena quantidade, é realizado o procedimento chamado enriquecimento que significa elevar a quantidade do microrganismo de interesse com relação ao restante da população (RAJAK, 1994; TORTORA & FUNKE, 2008).

-

OBJETIVOS

Isolar microrganismos estimulando seu crescimento para determinar a sua atividade enzimática.

-

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

- MateriaisOs equipamentos e materiais utilizados para o desenvolvimento do trabalho estão citados abaixo:

- Crescimento em placas

- Culturas microbianas contendo ou não colônias isoladas;

- 10 placas de Petri contendo meio YMA;

- Alça de platina;

- Bico Bunsen;

- Estufa de incubação

- Isolamento dos microrganismos

- Culturas microbianas da etapa anterior;

- 10 placas de Petri contendo meio de cultura seletivo;

- Bico Bunsen;

- Alça de platina;

- Estufa de incubação

- Crescimento em tubos

- Culturas microbianas isoladas na etapa anterior;

- 20 tubos de ensaio contendo meio YMA;

- Bico Bunsen;

- Alça de platina;

- Estufa de incubação

- Crescimento em meio seletivo e teste do halo

- Inóculos pré-selecionados;

- 30 placas de Petri contendo diferentes meio seletivos, previamente preparados;

- Bico Bunsen;

- Azul de metileno;

- Régua;

- Alça de platina;

- Estufa de incubação

- Atividade enzimática

- Ácido clorídrico;

- Shaker com temperatura controlada;

- Pipeta graduada;

- Centrifuga;

- Banho-Maria;

- Bico Bunsen;

- Gelo;

- Espectrofotômetro

- Métodos

- Crescimento em placas

Os microrganismos serão obtidos de diferentes fontes e serão inoculados em meio YMA, que por ser um meio rico permite o crescimento de bactérias, fungos e leveduras que poderão supostamente ser encontradas nas amostras coletadas. Feita a inoculação, as amostras deverão ser incubadas por 48 horas em estufa a 30°C. Depois de evidenciado o crescimento, os microrganismos serão codificados.

- Isolamento dos microrganismos

O isolamento de microrganismos consiste em separar uma espécie microbiana de outras a partir de uma amostra com várias populações, ou seja, comunidades mistas. Assim, após deixar as colônias em crescimento por três dias, seleciona-se uma amostra de cada colônia para realizar o isolamento em placas de meio YMA.

Inicialmente deve-se esterilizar a alça de repicagem e esperar o seu resfriamento. Com o auxílio da alça de repicagem, coleta-se uma colônia isolada da placa de Petri, já preparada anteriormente, contendo células já crescidas e transfere essa colônia para a superfície do meio já preparado em uma nova placa, espalhando o material conforme a técnica de estriamento composto. É necessário flambar e resfriar a alça de repicagem a cada esgotamento.

As amostras devem ser devidamente identificadas e incubadas a 27ºC por 24 horas.

- Crescimento em tubos

Para determinação da atividade