Contribuição ao conhecimento químico e biológico de plantas dos sertões de Crateús.

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3.2 Realização dos testes fitoquimicos.

Os testes fitoquímicos foram realizados seguindo a metodologia de Matos (1997), com o propósito de identificar compostos biológicos que possam ser usados para meios medicinais. Para a realização dos testes, tomaram-se alíquotas do extrato etanólico do ramo de M. charantia (EERMC) e dilui-se em uma solução hidroálcoolica, composta por 70 mL de álcool etílico e 30 mL de água destilada. Logo em seguida fracionado em 3 mL para 7 tubos de ensaio enumerados e 10 mL para dois béqueres e colocados para secar em temperatura ambiente. Estes testes baseiam-se na adição de reagentes específicos e na observação da mudança de coloração da solução do extrato.

No teste para fenóis e taninos foi pego um dos tubos de ensaio contendo 3 mL o extrato etanólico do ramo de M. charantia e foi adicionado três gotas de solução alcoólica de cloreto férrico (FeCl3 ). A solução foi agitada e observada à mudança de coloração ou formação de precipitado abundante e escuro.

No teste de antocianinas, antocianidinas e flavonóides foram utilizados três tubos de ensaios, onde dois deles foram alcalinizados para pH 8,5 e pH 11 respectivamente e o terceiro tubo foi acidulado para pH 3. Observou se ocorreu a mudança de coloração.

No teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas, foram utilizadas dois tubos de ensaio onde se adicionou a um tubo HCl para a obtenção de pH 1-3 e no outro NaOH para a obtenção de pH 11. Em seguida foram aquecidos com o calor de uma chama de vela por 2 minutos. Foi observado se houve alguma alteração na cor, comparando a tubos usados no testes anteriores. Para a confirmação da presença de catequinas, utilizou-se um palito umedecido na solução hidroálcoolica do extrato. Após a evaporação do extrato o palito foi reumedecido em HCl concentrado, com o auxílio de um bastão de vidro. Em seguida aquecido em calor de chama de vela por 2 minutos e observado se houve presença de coloração na face acidulada do palito.

Nos testes para flavonóis, flavonas, flavanonóis e xatonas foi adicionado ao tubo de ensaio de numero 7 alguns centigramas de magnésio em fitas juntamente com 0,5 ml de HCl concentrado. Observado a mudança de cor após o fim da reação de efervescência e comparado a tubos acidulados.

No teste para esteróides e triterpenóides (Lieberman-Burchard), foi extraído o resíduo seco do extrato de um dos béqueres com 1-2 mL de clorofórmio. A solução foi filtrada em um funil com algodão, coberto por sulfato de sódio anidro (NaSO4) para um tubo de ensaio. Imediatamente, foi adicionado 1 mL de anidrido acético, agitando-se a solução. Logo depois, adicionaram-se três gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Agitando-se a solução novamente e observou-se rápido se houve desenvolvimento de cores.

No teste para saponinas pegou-se o resíduo insolúvel em clorofórmio e o dissolveu com 5 ml de água destilada. Logo após filtrou-se a solução para um tubo de ensaio. Agitado por 2-3 minutos e observando a formação de espuma. Para o teste confirmatório adicionou-se 2 ml de HCl concentrado ao tubo e deixo-o em banho maria por uma hora. Ao esfriar agitou-se novamente e verificou se resultou a presença de precipitado e formação de espuma.

No teste para ácidos fixos fortes foi utilizado o resíduo do outro béquer onde foram adicionados 0,5 ml de clorofórmio, misturado bem e adicionado 1 ml de hidróxido de amônio (NH4OH) concentrado. Logo depois filtrado e colocado em banho Maria, ate não haver mais indícios de vapores de amônio. Posteriormente foi colocado para secar em estufa a 100ºC durante 10 minutos. Em seguida foi dissolvido em água e filtrado. A solução obtida foi dividida igualmente e transferida para dois frascos estilo penicilina e a um deles foi adicionado 1 ml de hidróxido de sódio (NaOH) e rapidamente fechados com fitas umedecidas com reagente de Nessler. Observou se adveio a mudança de coloração no frasco com NaOH.

Para o teste de alcalóides, tomou-se 1/3 da solução hidroálcoolica e adicionou-se hidróxido de amônio (NH4OH) para a obtenção de pH 10. Posteriormente as bases orgânicas foram extraidas com duas poções de 20 e 10 ml de clorofórmio em um funil de separação. Logo após retirou-se e tratou-se a solução de clorofórmio com Sulfato de sódio anidro (Na2SO4). Em seguida, adicionou-se 3 gotas de HCl concentrado. Em seguida a solução foi igualmente dividida para três fracos estilos penicilina. No primeiro fraco, adicionou-se 3 gotas dos reagentes de Hager, no segundo 3 gotas de reagente de Mayer no terceiro 3 gotas do reagente de Dragendorff. Observou se ocorreu à formação de precipitado característico.

3.3 Atividade e inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE)

Para a realização do teste de Inibição de Acetilcolinesterase foi utilizado 10 mg e 2 mg do extrato etanólico do ramo da M. charantia. Os testes de atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase (AChE) foram feitos no Laboratório de Produtos Naturais do Departamento de Química da Universidade Estadual do Ceará, sob a orientação da Profª Jane Eire Silva Alencar de Menezes.

A atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase (AChE), foi realizada através do método de Ellman (1961), modificado por Rhee e colaboradores (2001). O objetivo desse bioensaio é encontrar substâncias que apresentam a propriedade de inibir a enzima acetilcolinesterase, inibição essa que esta diretamente ligada ao tratamento da doença de Alzheimer (RHEE et al., 2001). Este bioensaio consiste na aplicação das amostras em Cromatografia de Camada Delgada (CCD), seguida da pulverização da placa com uma solução contendo o reagente de Ellman (DTNB - ácido 5,5’-ditiobis-[2-nitrobenzóico]) e uma solução de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampão apropriado. É considerado um método colorimétrico e que pode ser utilizado de forma qualitativa e quantitativa (no caso desse trabalho, foi utilizado apenas o modo qualitativo). É um método rápido e sensível para a pré-seleção de amostras com ação anticolinesterásica. O método de Ellman é um procedimento fidedigno para atividade da acetilcolinesterase e pode ser rotineiramente empregado para avaliar a atividade inibitória de constituintes químicos.

Para o referido teste, utilizou-se uma alíquota de 5 μL da amostra de EERMC a serem testadas na concentração de 2mg/mL dissolvidas em metanol e aplicadas em uma cromatoplaca. Após a evaporação dos solventes, pulverizou-se uma mistura (1:1) ATCI 1 mmol.L-1 com o reagente de Ellman (ácido 5,5’ – Ditiobis-[2-nitrobenzóico], DTNB, 1 mmol.L-1),