Digestão Enzimática de DNA

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- INTRODUÇÃO

Atualmente, é muito comum ouvirmos notícias sobra a nanotecnoligia e a biotecnologia. Esse feito ocorre devido aos grandes avanços da tecnologia, genética e outras áreas da ciencia que estão cada vez mais empenhadas em descobrir novas soluções para o nosso mundo.

Um exemplo muito importante é a enzima de restrição. Com os avanços da engenharia genética, descobriu-se tais enzimas a partir de bactérias que, produziam enzimas para se protegerem do ataque de vírus e assim, inativavam o potencial infeccioso do organismo invasor. A partir disso, várias enzimas passaram a ser purificadas e então comercializadas por laboratórios do mundo todo.

As enzimas de restrição também podem ser chamadas de endonucleases (endo = dentro; nuclease (enzima) de restrição que são enzimas que irão cortar a molécula de DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas.

Essas enzimas são específicas em seu reconhecimento isto é, cada tipo corta apenas uma determinada sequência de nucleotídeo.

É importante salientar que existem três tipos dessas enzimas de restrição, sendo elas TIPO I; TIPO II (as mais utilizadas nos dias de hoje. Atua cortando a cadeia de DNA em uma posição interna ao invés de começar a cortar pelas pontas.) eTIPO III, porém é muito difícil utilizar-se dessas especificações, as enzimas são geralmente conhecidas apenas por “enzimas de restrição”.

Para a enzima trazer bons resultados, o DNA precisa estar íntegro ou seja, sem alterações que estejam fora do “conhecimento digestivo” da enzima, caso contrário, não são detectados.

Alguns exemplos de enzimas são citados na tabela abaixo, junto com a sua origem. Para finalizar, as enzimas de restrição têm uma enorme importancia nos testes de paternidade, identificação de pessoas e crimes e outros.

Para uma boa visualização de resultados, utiliza-se a eletroforese em gel e também pode ser corado com uma substancia fluorescente.

Enzimas de restrição

Origem

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens

EcoRI

Escherichia coli

HindIII

Haemophilus influenzae

KpnI

Klebsiella pneumonia

PstI

Providencia stuartii

SacI

Streptomyces achromogenes

SalI

Streptomyces albue

SmaI

Serratia marcescens

SphI

Streptomyces phaeochromogenes

XbaI

Xanthomonas badrii

Tabela 1- enzimas de restrição e suas origens

2. OBJETIVO

Realizar a digestão enzimática, simples e dupla,e montar um mapa de restrição de um DNA plasmidial a partir dos dados obtidos após eletroforese em gel de agarose

2.1. OBJETIVO GERAL

Verificar os cortes de DNA das enzimas

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar e comparar os diferentes locais de corte de cada enzima e construir um mapa com o resultado de todas.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

- Agarose

- Água destilada

- DNA de plasmídeo

- Enzima Bam HI

- Enzima Eco RI

- Ependorf

- Micro-pipeta

- Tampão

3.2 MÉTODOS

Foram retirados do isopor de gelo, as amostras de Dna e das enzimas necessárias para o experimento, após descongelamento para a digestão simples foi pipetado 5 microlitros de Dna, 2 microlitros de tampão de enzima, 1 microlitro de Bam HI e completado com 12 microlitros de H2O no tubo de 200 microlitros. Em seguida para a digestão dupla foi pipetado 5 microlitros de Dna, 2 microlitros de tampão de enzima, 1 microlitro de Eco RI e 1 microlitro de Bam HI e completado com 11 microlitros de H2O.

Logo após foram colocados os tubos em banho maria (37o C) por 30 minutos enquanto se prepara o gel de agarose. Após preparação foi pipetado as duas digestões no gel de agarose e ligado para realizar eletroforese que gerou a foto enviada pelo professor para comparação dos resultados.

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

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5. CONCLUSÃO

Pode-se concluir, com base nos experimentos e no conhecimento prévio adquirido através de aulas expositivas e consulta à literatura, que as enzimas de restrição clivam (cortam) o DNA em fragmentos de acordo com o tipo e origem de enzima. É de extrema importância que se conheça o sítio de restrição de cada enzima, para que se faça amplo uso de sua aplicação nas mais diversas áreas da biotecnologia.

Os resultados obtidos com o experimento em aula, que foi a verificação dos fragmentos resultantes da digestão através do uso de endonucleases, foram conseguidos graças ao uso da técnica de eletroforese em gel. Esta técnica baseia-se no carreamento de fragmentos proteicos através de carga elétrica, influenciados pela massa de cada fragmento.