Tecnicas de Biologia Molecular

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Enzimas de Proteusvulgaris reconhecem sequências diferentes mesmo sendo do mesmo organismo.

Outra coisa importante para essas sequências são que sequências de restrição são sequências palindrômicas, que são distribuídas no DNA, as fitas da sequência de restrição quando lidas do sentido 5’-3’ são iguais. No slide em uma fita: GAATTC e na outra GAATTC. Normalmente essas sequências são curtas de 4 a 8 nucleotídeos, geralmente são 4 e 6.

Existem as enzimas de restrição que tem as sequências de reconhecimento degeneradas. No meio da sequência pode ter qualquer base, N, só no começo e final da sequência as bases não devem alterar e as enzimas reconhecem. Essas sequências não serão palindrômicas.Por exemplo a enzima himf I.

Tem uma tabela no cap9 do lehninguer, que mostra alguns sítios de restrição para algumas enzimas importantes. De um lado tem a enzima e do outro o sítio de restrição.

A nomenclatura dessas enzimas de restrição é a abreviação de qual microorganismo a produziu. A enzima chama Eco. vem de E. coli, RX é da linhagem que ela foi tirada e o número é da ordem em que ela foi descoberta nesse mO.

Como funciona a hidrólise enzimática? O alvo da enzima é a ligação fosfodiéster onde ela quebra, toda enzima que tem alvo a ligação fosfodiéster precisa de magnésio para estabilizar o complexo intermediário seja de formação ou de quebra. Para as enzimas de restrição esse magnésio pode ser substituído por manganês ou cátion divalente, mas o ideal é o magnésio. Ocorre a hidrólise gerando uma extremidade 3’OH e uma 5’fosfato.

Quando ocorre a hidrólise podem ser formados 2 tipos de corte formando dois tipos de extremidade:

- Formação de extremidades cegas – o corte ocorre em um local direto nas duas fitas

- Formação de extremidades coesivas – tem o sítio de reconhecimento, mas a enzima não corta no mesmo lugar desse sítio, ela corta em um nucletídeo e depois na outra fita corta um pouco mais a frente, formando uma extremidade com fita simples. Esse pedaço formado é complementar ao outro na outra fita.

Depois pode gerar sítios com extremidades coesivas e ligar sequências diferentes, somente com a sequência igual na extremidade, gerando uma alteração na sequencia do DNA. A outra enzima necessária para que isso ocorra é a ligase que vai ligar os fragmentos com extremidades coesivas

As enzimas de restrição que formam extremidades coesivas podem ter diferentes sítios de restrição e formar as mesmas extremidades coesivas, as fitas simples. Sítio de reconhecimento para BanhI é um e a extremidade é a mesma que a de outras enzimas. Isso é importante pois pode usar diferentes enzimas para cortar o DNA em diferentes pontos e unir essas extremidades formadas mesmo os sítios de restrição sendo diferentes.

Como se pode prever a freqüência da sequência de reconhecimento em uma molécula de DNA? Dá para prever tendo conhecimento do tamanho do DNA, fazendo uma análise combinatória tentando descobrir qual a probabilidade de encontrar quantos sítios de restrição para uma determinada enzima dentro do DNA. Para isso é necessário imaginar que dentro do DNA as sequências são distribuídas de maneira aleatória e que o percentual de bases é o mesmo, 25% de cada uma, pode-se fazer a conta de acordo com o número de pares de bases que a enzima reconhece. Eleva-se 4 ao número da sequência te dá o resultado de quantas vezes a enzima vai cortar na molécula.

Nos DNAs naturais as sequências de nucleotídeos não são distribuídas de maneira aleatória.São distribuídas em forma de genes de acordo com a necessidade da célula, outra coisa é que o DNA não tem a mesma concentração de bases. Como os nucleotídeos não são ordenados de forma aleatória no DNA os fragmentos nunca são do mesmo tamanho. Na prática precisa ser testado, o bacteriófago lambda tem genoma com 48513 pares de bases, se pegar a enzima BGL2 que tem sítio com 6 pares de bases nesse caso geraria uns 12 fragmentos de DNA, de 46, na realidade, tem o mapa de restrição,para BGL2 só tem 6 sítios de restrição (distribuição não aleatória e composição de bases diferentes). As outras enzimas se comportam da mesma forma. Além do fato que os tamanhos dos fragmentos são diferentes. Isso quer dizer que a matemática só da idéia, mas para saber exatamente onde a enzima de restrição corta deve-se fazer o mapa de restrição.

MAPA de RESTRIÇÃO

1ª coisa: fazer digestão com as enzimas de restrição – pipetar a quantidade de DNA. Depois de extraído e quantificado o DNA, determina a quantidade de que vai ser usada pela quantidade de DNA, e qual volume a ser colocado. Se a concentração é maior o volume é menor. Se você conseguiu extrair 4microg/microLe você precisa de 2, você pipeta 0,5 microL.

2ª coisa: colocar a enzima em meio adequado, com pH ótimo, em tampão da enzima. Toda enzima purificada vem com tampão da enzima. A maioria das enzimas funciona em pH perto da neutralidade. Nesses tampões já vem com o magnésio.

3ª coisa: força iônica, concentração de sal, NaCl.

Essas enzimas, às vezes vem com um agente redutor, tem alguns sítios ativos que são sensíveis à oxidação. O agente redutor protege a enzima e a mantém ativa por mais tempo.

Adicionou o tampão e agora adiciona a enzima (vem em unidades/microL). Uma unidade de enzima é a quantidade necessária para clivar um micrograma de DNA em uma hora. Isso é o significado da unidade de atividade enzimática no caso das enzimas de restrição, esse conceito muda de enzima para enzima. Vai ter X unidades de enzimas para X microgramas de DNA.

Exemplo: Se você tem 2mcg de DNA, vai precisar de 2 unidades de enzima. Se a enzima vem 4 unidades por mcL você precisa pipetar 0,5 mcL da enzima. Como a enzima é cara não pipeta a mais.

Depois coloca água (quantidade suficiente para 20 mcL), mas olha na bula da enzima. Incuba, importante temperatura, toda enzima tem temperatura ótima de atuação a maioria funciona a 37ºC, mas pode variar dependendo do organismo no qual ela foi extraída, e o tempo de reação, se eu coloquei enzimas suficientes para uma hora é necessário ficar uma hora, se for muito mais que isso pode ocorrer cortes inespecíficos, se for menos pode ocorrer cortes parciais. Tem-se então o DNA clivado e precisa então inativar a enzima, pode ser incubando a enzima a uma alta temperatura por pouco tempo e desnatura a enzima. Pode fazer extração