Biologia molecular

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DNA (μg/mL) = valor da leitura em A260 x 50 x fator de diluição.

As proteínas absorvem luz a um comprimento de onda de 280 ηm. Assim, a relação das absorbâncias a 260 e 280 ηm (A260/A280) fornece um parâmetro de avaliação da qualidade das purificações de ácidos nucléicos. Valores da relação A260/A280 inferiores a 1,8 ocorrem devido à contaminação por proteínas na amostra. Na presença de contaminantes, a leitura da concentração de DNA por espectrofotometria fica comprometida.

Material utilizado

Água ultrapura;

Amostras de DNA ;

Cubetas de quartzo (desengorduradas e limpas com lenço de papel);

Espectrofotômetro para luz UV;

Jogo de micropipetas e ponteiras;

Tubos de polipropileno de 1,5 mL para microcentrífuga;

Leitura no espectofotômetro

Ligar o espectrofotômetro 30 minutos antes da leitura (aquecendo a luz ultravioleta);

Obter 500 μL de DNA diluído em água ultrapura a 1:50 (ex: 10 μL da amostra de DNA diluída em 490 μL de água ultrapura);

Ajustar o comprimento de onda para 260 ηm e zerar o espectrofotômetro com 500 μL de água ultrapura;

Efetuar a leitura da amostra diluída de DNA;

Ajustar o comprimento de onda para 280 ηm e zerar o espectrofotômetro com 500 μL de água ultrapura;

Efetuar a leitura da amostra novamente;

Interpretação do resultado

Os dados abaixo exemplificam os resultados obtidos em uma leitura:

Leitura da amostra a 260 ηm: 0,5

Leitura da amostra a 280 ηm: 0,25

Diluição da amostra: 1/100

A pureza da amostra será calculada pela fórmula: A260/A280: 0,5/0,25 = 2,0 que corresponde a uma amostra de boa qualidade.

A concentração de DNA é calcula pela fórmula: = valor da leitura em A260 x 50 x fator de diluição = 0,5 x 50 x 100 = 2500 μg/mL. Se o volume de amostra é de 100 μL, então a quantidade de DNA obtida é de 250 μg.