Biologia Molecular

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Outro método tradicional, porém mais rápido e de grande importância o qual foi muito utilizado, foi o proposto por Frederick Sanger na década de 70 e consiste na adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxirribonucleotídeos trifosfatados, que impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição.

O método de Sanger é mais sofisticado do que o de Gilbert por vários motivos. O primeiro é que o método de Gilbert é realizado por meio de degradação química e requer grande quantidade de DNA purificado e muitos passos de purificação, enquanto o do Sanger por meio de sequenciamento enzimático e requer pouco DNA. Além disso, o mais clássico produz curtas leituras e digestões enzimáticas, e já o mais moderno produz maiores leituras além de não necessitar de digestões.

Com o avanço na biologia molecular, houve um grande salto na ciência com o desenvolvimento de métodos mais eficientes e modernos, utilizando o sequenciamento automático. O uso dos sequenciadores automáticos é essencial quando se deseja realizar sequenciamento em larga escala, como nos projetos genoma. O desenvolvimento e utilização de sequenciadores automáticos tornam mais eficaz e rápido o sequenciamento de DNA, já que as etapas de leitura do gel e o processamento de sequências são realizadas através de programas de computador. A reação de sequenciamento é baseada no método de Sanger. Entretanto, no sequenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos ao invés de isótopos radioativos. Quatro diferentes fluorocromos são empregados na molécula e uma vez excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda.

Atualmente existem muitas técnicas sofisticadas que permitem esse processamento de sequenciamento automático podendo ser elencadas algumas delas como: método de shotgun, método de pirosequenciamentos, método de hidro-pump, sequenciamentos de hibridação, colônias de polimerase, sequenciamento por nanoporos, espectrometria de massa e entre outros.

A tecnologia empregada na análise genômica hoje sofreu dramático progresso em pouco tempo. No final da década de 70, por exemplo, eram sequenciados genes com alguns milhares de bases de DNA. No final dos anos 90, sequenciadores automáticos de DNA são capazes de sequenciar meio milhão de pares de bases por dia. Mapas genéticos que levariam anos para ser construídos com marcadores moleculares nos anos 80, hoje podem ser construídos em poucos dias.

Referências:

http://www.biomol.org/historia/existencia.shtml

http://genoma.ib.usp.br/wordpress/wp-content/uploads/2011/04/Projeto-Genoma-Humano.pdf

http://global.britannica.com/EBchecked/topic/422006/DNA-sequencing#ref1011077

http://www.ibb.unesp.br/Home/Departamentos/Morfologia/Laboratorios/LaboratoriodeGenomicaIntegrativa/ag2013-3-sequenc-dna-cmartins.pdf

http://www.oocities.org/br/curiobio/SHOTGUN.htm

http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CNPA-2009-09/22214/1/DOC191.pdf

http://ppgcf.ufvjm.edu.br/~ppgcf/sites/default/files/marcelolaia/files/aula_09_sequenciamento_thumb.pdf

http://www.unioeste.br/cursos/cascavel/biotecnologia/aulas/2008/aula_seq_genomico_2008_biotec.pdf

http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio17/17_docg.pdf