Carta de motivos

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2.3.Visualização da formação de Corpúsculos Lipídicos.

Após 10 minutos de fixação com formalina 3,7% pH 7,4, foram feitas 3 lavagens com PBS pH 7,4 nas lamínulas. Em seguida, elas foram incubadas com Propilenoglicol 100% por 2 minutos,após foi retirado o Proprilenoglicol e adicionado Oil Red 0,5%,que permaneceu sobre as lamínulas por 15 minutos. Em seguida,foi removido o Oil Red 0,5% e adicionado Propilenoglicol 60% por 1 minuto,e então as lamínulas foram lavadas 3 vezes com PBS pH 7,4 e depois coloridas com Hematoxilina por 10 segundos. A seguir, as lamínulas foram retiradas dos poços das microplacas e fixadas em uma lâmina com Entellan. As lâminas foram visualizadas em microscópio de luz e foram contados CL em 50 células por lâmina de cada fator.

2.4. Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)

As concentrações das citosinas IL-10 e IL-12 foram determinadas por ensaios enzimáticos (ELISA ) conforme as recomendações do fabricante.

2.5.Ensaio de sobrevivência in vivo

Para avaliar a influência do T6SS na capacidade da APEC de colonizar o hospedeiro foram infectados camundongos da linhagem C57Bl6 com uma suspensão de 1x107 células/mL em solução salina de cada linhagem bacteriana. Após 24h de infecção, os camundongos foram sacrificados e tiveram seus fígados retirados. Os órgãos foram macerados por fricção, utilizando a superfície esmerilhada de lâminas de vidro e 100µL desse macerado foi espalhado em meio seletivo MacConkey.As placas foram encubadas overnight e contadas as Unidades Formado de Colônias (C.F.U).

2.6.Dosagem de Óxido Nítrico.

A dosagem de nitrito no sobrenadante foi feita usando o método calorimétrico de Griess,segundo Miranda et al,2001.

2.7.Análise Estatística e Gráficos

Todos os testes (formação de corpúsculos lipídicos e ELISA) foram comparados utilizando One-Way ANOVA seguido de Bonferroni. As diferenças foram consideradas significativas com o valor de P ˂0,05. As análise e gráficos foram executados no programa GraphPad Prism versão 6. Nos gráficos estão representados média e desvio padrão.

3.Resultados e Discussão

3.1.Formação de corpúsculos lipídicos

A partir da coloração Oil Red foi possível a contagem de CL por células (Figuras 1 e 2). Nos macrófagos infectados pela SEPT 362 foi observado o número médio de 6,9 CLs por célula, valor próximo aos observados nos macrófagos não estimulados (CONTROLE) que tiveram 7,4 CLs por célula ,e inferior em relação ao controle positivo (LPS) que teve 15,16 em média. Indicando que a SEPT 362 altera a biogênese de corpúsculos lipídicos .

Os macrófagos estimulados pela mutante ∆icmF apresentaram uma média de 18,76 CLs ,que é superior a apresentada pelo controle e próxima ao do LPS.. Esses resultados sugerem um papel fundamental da proteína Icmf e, consequentemente, do T6SS na imunomodulação lipídica, já que em sua ausência não é observada o decréscimo de CLs. Resultado semelhante é observada com a cepa ∆clpv,com a média de 22,26 CLs, o que indica que essa proteína também é essencial para modulação pelo T6SS.

Os macrófagos infectados com a cepa ∆hcp tiveram média de 6,7 CLs , mantendo o fenótipo apresentado pela SEPT 362.Levando a conclusão que essa proteína não exerce um papel na alteração da biogênese de corpúsculos lipídicos.

[pic 2]

Figura 1-Média de corpúsculos lipídicos em macrófagos após infecção.

[pic 3]

Figura 2– Fotos da coloração Oil Red.Aumento 63x.A :Controle B: 362, C: ∆Icmf, Os corpúsculos lipídicos estão corados em vermelho.É possível observa um número menor de corpúsculo em C ,comparando a A e B..

3.2.Produção de IL-10 e IL-12

Os resultados da ELISA (Figuras 3 e 4) mostraram um perfil favorável para o crescimento intracelular da SEPT 362.As concentrações da citosina anti-inflamatória IL-10 foi significantemente maior nos macrófagos infectados pela SEPT 362 do que no controle .As concentrações da ∆Icmf foram menores que as apresentadas pela SEPT 362,mas tiveram um número elevado comparado a controle ,indicando que o T6SS provavelmente não esta diretamente relacionado a síntese dessa citosina, considerando que, na ausência de um componente essencial desse sistema ainda é visível uma concentração maior de Il-10 comparando a controle.

[pic 4]

Figura 3-Produção de IL-10 em macrófagos após infecção. Controle representa macrófagos não infectados.

Comparando as concentrações de IL-10 com a citosina pro inflamatória IL-12 (figura 4) observasse uma maior quantidade de IL-10 do que IL-12 em todos os tratamentos.A baixa liberação de IL-12 na presença da SEPT 362 sugere uma manipulação da resposta imune pela bactéria visando sua sobrevivência.Novamente não é visível interferência do T6SS na síntese da citosina.

Experimentos estão em andamento para avaliar se o T6SS pode influenciar na síntese de outras citosinas.

[pic 5]3.3.Sobrevivência in vivo[pic 6]

Os resultados do ensaio de sobrevivência demostra que o T6SS é essencial para a colonização do hospedeiro (Figura 5). A cepa selvagem teve elevado número de C.F.U ,enquanto as suas variantes mutadas no T6SS tiveram uma diminuição significativa no número de colônias.A deleção da proteína IcmF foi a mais que mais prejudicou a capacidade da cepa de colonizar o hospedeiro.

[pic 7]

Figura 5-Unidades Formadoras de Colônias por grama de fígado. Deleções em componentes do T6SS acarretam diminuição da sobrevivência in vivo.

3.4.Dosagem Óxido Nítrico

O óxido nítrico é uma espécie reativa de oxigênio produzida por macrófagos como mecanismo de defesa a infecções bacterianas.(Havixbeck et al., 2015).Entretanto algumas bactérias são capazes de sobreviver utilizando mecanismos anti-oxidativos ,por meio de dismutases, peroxidases e catalases.(Eason and Fan, 2014).Nossos resultados indicam que a SEPT 362 tem mecanismos de defesas