A QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS PELO MÉTODO DE BRADFORD

FARMÁCIA - FA3N

AMANDA ALVES SANTIAGO

GABRIEL MACHADO

ISABELA CARRARO RUBIM

ISMAEL LOUREIRO RODRIGUES

ROBERTA TAMAGNONI DEL PUPPO

Prática nº 04 (12/04/2022)

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS PELO MÉTODO DE BRADFORD

Disciplina: Bioquímica

Professor: Márcio Fronza

VILA VELHA

ABRIL 2022

1. INTRODUÇÃO

O método, descrito pela primeira vez pelo Dr.. Marion Bradford em 1976, é baseado em uma reação colorimétrica de proteínas com um corante, Coomassie Brilliant Blue G-250. É o método mais usado para dosagem de proteínas totais e utiliza a albumina do soro bovino (BSA) como padrão, que é um reagente de baixo custo.1

A dosagem de proteínas permite a quantificação exata da concentração de proteínas numa determinada amostra vegetal; sendo uma etapa fundamental devido à necessidade de se utilizar uma concentração conhecida nas etapas subsequentes. 1

As proteínas se ligam ao corante em um ambiente ácido, induzindo uma mudança espectral da cor de marrom para o azul. As interações hidrofóbicas e iônicas com as proteínas na amostra estabilizam a forma aniônica do corante, causando uma mudança de cor visível. 2

O reagente azul brilhante de Coomassie altera a absorbância de 465 nm para 595 nm causando uma visível mudança de coloração, inicialmente castanha, para tons de azul, conforme a concentração de proteínas. 1

2. OBJETIVO

Quantificar as proteínas totais de diversas amostras (soro humano, leite materno, leite de vaca, tecidos de animais, alimentos, células,...) utilizando métodos espectrofotométricos de Bradford.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

* Espectrofotômetro com comprimento de onda de 595nm

* Cubetas com caminho ótico de 1cm

* Tubos testes de 13 x 100 nm

* Pipetas graduadas e volumétricas

* Micropipetas de 1 ml e de 20 a 200 microlitros

3.2 Reagentes

* Reagente de Bradford

* Solução Estoque de Albumina do Soro Bovino(BSA) 1mg/ml

* Água destilada

4. PROCEDIMENTOS

4.1. PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Numeramos 6 microtubos (1-6), cada microtubo com 1 mL de água destilada.

No microtubo 1 foi adicionado 1 mg/mL de BSA com 1 mL de água destilada. A solução BSA foi preparada com 2 mg de BSA e diluída com 2 mL de água destilada, tendo um resultado final de concentração de 1mg/mL.

Em seguida com a solução do microtubo 1 realizamos uma diluição seriada, que foi pego 1 mL do microtubo 1 transferido para microtubo 2 e fazer a diluição com 1 mL de água, repetindo o mesmo procedimento para todos os microtubos e no microtubo 6 fizemos o descarte de 1 mL.

Após a experiência fizemos os cálculos da concentração dos microtubos contendo a solução padrão de BSA.

Em seguida, transferimos 50 μl de cada microtubo para tubos de ensaios e colocamos no fundo do tubo. A cada tubo adicionamos 2 mL da solução de Bradfort e levamos para o espectrofotômetro obtendo a leitura da absorbância a 595 nm.

4.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNAS NO LEITE DE VACA

Para a determinação do teor de proteínas no leite de vaca, medimos 1 mL de leite de vaca com a pipeta e transferimos para um béquer contendo 29 mL de água destilada.

Dessa solução medimos 50 μl e colocamos no tubo de ensaio e adicionamos 2 mL de solução de Bradford, levamos para o Espectrofotômetro, obtendo a leitura de absorbância a 595 nm.