Relatorio de microbiolgia

...

As preparações a fresco revelam que os microrganismos são incolores e semitransparentes, o que dificulta a visualização e o discernimento de algumas estruturas internas. Devido a tais dificuldades, foram criadas técnicas de fixação e coloração de material biológico.

Afixação impede que o material se desprenda da lâmina no curso das manipulações posteriores, podendo ser feita pelo calor-método mais utilizado e por meios químicos como o álcool etc.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas permanentemente e preservadas como a documentação. (KAMAYO,2012)

O método consiste no tratamento de uma amostra contendo bactérias, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta, devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel (iodopararrosanilina), em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo violeta-iodo é removido descolorando as células. (KAMAYO,2012)

- PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

4.1 Equipamentos

- Microscópio óptico

4.2 Materiais

- lâmina de vidro

- alça de inoculação

- algodão

- pregador de madeira

- bactérias Gram-positivas e Gram-negativas em culturas

- recipiente para coloração de Gram

- água corrente, água destilada

- detergente

- álcool a 70%

- cultura bacteriana em caldo (E.coli)

- cultura bacteriana em caldo (Aurus)

- reagentes para a coloração de Gram (violeta, lugol, álcool, fucsina)

- pipeta

- bico de Bunsen

- PROCEDIMENTO

I Parte: o grupo ficou com cultura do meio líquido.

A lâmina foi lavada/esterilizada com detergente primeiro, depois com água de torneira, água destilada e por último passou algodão e álcool (esfregaço); Logo depois a lâmina foi secada na chama do bico de Bunsen; após flambar a alça, e retirar 1 alçada foi depositado no centro da lâmina previamente limpa e identificada 2 gotas de suspensão bacteriana (E.Coli), secou a lâmina no bico de Bunsen de maneira que as células bacterianas ficassem bem distribuída sem formar aglomerados; depois foi mergulhada a lâmina no álcool a 70%; novamente foi espalhada 2 gotas de suspensão bacteriana (E.Coli), mas em uma outra lâmina que foi secada no bico de Bunsen; outra vez foi colocado e espalhado 2 gotas de Aurus na lâmina que foi secada n bico de Bunsen; depois foi levada para o microscópio colou a lâmina na objetiva 40x e nada foi visto então, retirou-se a lâmina sem alterar o foco colou-se 1 gota de óleo de imersão na objetiva e aumentou a mesma para 100% foi encontrado bacilos mortos.

II Parte: Método de coloração de Gram

Depois do processo da primeira parte do método de Gram foi fixado uma suspensão de microrganismos (E.Coli) em uma lâmina; depois a lâmina fixada foi coberta com solução de cristal de violeta; aguardou-se 1 min e desprezou-se o corante; logo após foi coberto a lâmina com solução de lugol, aguardou 1 min e desprezou o corante; depois inclinou a lâmina e foi gotejado álcool, lavou com água, aguardou-se 30 segundos; depois foi coberta com Fucsina de Gram e guardou –se 40 segundos; depois a lâmina foi lavada com água e secada com papel e por último foi adicionado sobre o esfregaço corado 1 gota de óleo de cedro e foi levado ao microscópio e examinada na objetiva de imersão.

- RESULTADOS E DISCUSSÕES

Depois de todos os procedimentos necessários foi visto bactérias Gram-negativas (em forma de bacilos mortos): sem coloração.

O descoramento para mais ou para menos é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool.

A idade da cultura bacteriana tem Importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células. Gram-positivas frequentemente se tomam Gram-negativas.

Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da Gram-negatividade da cultura, uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas como Gram-positivas, tal como Staphylococcus aureus e Gram-negativas, tal como Escherichia coli, como

Controles.

Na figura abaixo - P. aeruginosa: Bacilos mortos gram-negativos sem coloração:

[pic 1]

6. CONCLUSÃO

O objetivo desta prática foi realizado com pleno êxito. Ocorrendo apenas alguns erros durante a realização do foco, devendo esta falha estar vinculada a algum problema nas soluções ou pouco material (suspensão bacteriana).

Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia