Montando uma filogenia com dados moleculares provenientes do GenBank Milton Groppo

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deleções), sendo relativamente fácil de alinhar.

Alinhando as seqüências manualmente:

Utlizaremos o programa BioEdit, muito utilizado na edição de sequencias e com alguns recursos de alinhamento

Após abrir o programa clique em File>open. Escolha a pasta que salvou os arquivos, e depois em Cycas_revoluta_rbcL. O programa abrirá a sequencia. Note que do lado esquerdo está a identificação da sequencia, e do lado direito a seqüência. No lado esquerdo, edite a sequencia dando dois cliques no mouse (os cliques devem ser espaçados um pouco). O nome aparecerá em azul. Edite o nome (deixe apenas o gênero, Cycas, para facilitar) marcando com as teclas shift, as setas e delete.

Agora devemos colocar as outras seqüências. Clique em File>Import>sequence alignment file. Aparecerão as seqüências (para isso, vá em "All files", na opção "arquivos do tipo"). Dê um clique na sequencia seguinte ("Dicksonia thyrsopteroides"). Ela será exportada para a janela ativa, logo abaixo da seqüência de Cycas. Edite o nome da sequencia como em Cycas.

Agora podemos começar a alinhar as seqüências. Em mode (lado esquerdo, 2a linha) escolha "Edit"; ao lado surgirá uma régua com a opção "overwrite". Role para baixo e escolha "insert". Esses dois passos possibilitarão a edição das seqüências.

Para facilitar a visualização das seqüências, na terceira linha clique em "black-colored view mode". Os comandos desse grupo são utilizados para visualização das seqüências.

Na régua inferior, role até o final das seqüências. Você notará que a seqüência de Dicksonia é mais curta que a de Cycas. Isso porque muitas vezes as seqüências inteiras não são publicadas, ou por problemas no sequenciamento ou outros motivos.

Como a seqüência de Dicksonia é mais curta, para alinhar teremos que adicionar traços nessa sequencia, até coincidirmos as bases, em uma hipótese de homologia. Para isso, clique no começo da seqüência e tecle "-". Uns 29-30 traços serão suficientes. Para facilitar, o tamanho das letras pode ser diminuído. Percorra as seqüências e verifique o alinhamento.

Agora as outras seqüências podem ser importadas. Repita a operação com as seqüências em ordem alfabética. Se errar, delete a seqüência (marque a seqüência, vá em Edit>delete sequence) e comece de novo.

Em Laurus, a seqüência é mais longa que de Cycas e Dicksonia. Insira os traços em Dicksonia para alinhar com Laurus (cerca de 17 traços), anotando quantos traços foram colocados, para facilitar o alinhamento de Cycas com as outras duas seqüências.

Percorra as seqüências. Você notará que algumas regiões são quase idênticas. Essas regiões são chamadas de "âncoras" e são mais conservadas, facilitam o alinhamento.

No final, você verá que as primeiras 50 posições são mais difíceis de alinhar, sendo as duas pontas mais variáveis.

Como a seqüência de Pinus é a mais longa, no final terão que ser inseridos traços nas outras seqüências, para que os programas possam reconhecer todas as posições do alinhamento. É usual também cortar as primeiras e últimas posições, mas não faremos isso.

Salvando o alinhamento: File>save as>[nomeie o arquivo, por exemplo, alinhamento_exercicio_rbcL]. Salve como Fasta. Isso possibilitará voltar e editar o arquivo original, sempre que preciso.

Passo 4: análise

Utilizaremos o programa PAUP* (Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and other methods), versão 4b10 (Swofford, 2003) para as análises. PAUP* é um programa muito usado, abrangendo métodos baseados em distância e caracteres (parcimônia e máxima verossimilhança), além de executar testes de congruência e outros. Existem versões para plataformas UNIX, PC-Windows, Mac, etc. o formato de entrada é chamado de NEXUS, que, em síntese, consiste em um cabeçalho indicando o início do programa, seguido dos blocos de táxons e de caracteres, além das sequencias e de comandos para finalizar a leitura do arquivo.

Exemplo de cabeçalho:

#NEXUS

BEGIN DATA;

dimensions ntax=8 nchar=1449;

format missing=?

symbols="ABCDEFGHIKLMNPQRSTUVWXYZ"

interleave datatype=DNA gap= -;

Salvando em Nexus: há maneiras diferentes de salvar um alinhamento que está em FASTA (que o PAUP não reconhece) para NEXUS:

Nessa aula, utilizaremos o programa ClustalX para converter o arquivo FASTA em NEXUS. Abra o programa, clique em File>load sequences. Procure o arquivo FASTA do alinhamento . Depois de aberto, vá em File>Save sequences as, e escolha NEXUS. Clique em OK. Será criado um arquivo com o mesmo nome do arquivo FASTA original, mas com extensão *.nxs ou *nex. Este arquivo será alocado na mesma pasta do arquivo original. Abra o novo arquivo em um processador de texto (word ou wordpad) e observe o cabeçalho, matriz de dados e outros comandos.

No próprio BioEdit, existe uma opção de criar um arquivo NEXUS: com o alinhamento aberto, vá em File>Export>sequence alignment>save as type [nomeie o arquivo, de preferência com o mesmo nome do alinhamento e escolha PAUP/NEXUS]. O aplicativo utilizado é o READSEQ.EXE para DOS (Copyright 1990 by D.G.Gilbert, Biology Dept., Indiana University, USA). Entretanto, novas versões não permitem rodar alguns programas no ambiente DOS enquanto o Windows é executado.

Depois de salvar o alinhamento em NEXUS, o arquivo já pode ser utilizado no PAUP*. Abra o programa (usualmente uma janela abre informando um "Error"; clique apenas em OK). Procure o arquivo do alinhamento e abra.

Essa versão do PAUP* utiliza linhas de comando. Isso quer dizer que teremos que digitar as ações. Se teclar “?” uma lista de comandos estará disponível. Para ter informações sobre um tópico, deve-se digitar o tópico, mais espaço e “?”. Por exemplo: [ingroup ?] você terá uma lista de comandos para essa opção. Tente digitar “showmatrix”. A matriz de dados (o alinhamento) será exibida.

Podemos agora “brincar” com o nosso alinhamento produzido.