LABORATÓRIO DE FITOPATOLOGIA – EMBRAPA AMAZÔNIA ORIENTAL

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e seco em papel filtro (Figura 3). Posteriormente, os fragmentos foram transferidos para placa de Petri contendo ágar-água, e as placas vedadas com filme plástico e identificadas.

Figura 3. Processo de desinfecção de material vegetal de cebolinha e pimenta de cheiro.

Inoculação de fungo: outra atividade desenvolvida ao longo do ESO foi a inoculação de fungos, ou seja, o teste de postulado de Koch. Na pesquisa, essa técnica é empregada para provar a patogenicidade de determinado organismo. Existem vários tipos de inoculo, como os esporos, escleróides e microescleróides, clamidósporo ou fragmento de micélio.

A inoculação feita na pimenta de cheiro com o patógeno do gênero Colletotrichum foi realizado através da deposição de disco de micélio e pulverização de suspensão conidial em plantas sadias.

O método por deposição de disco de micélio foi realizado da seguinte forma: com auxílio de uma agulha, foram feitas micro-lesões no limbo foliar, sem atravessar o mesmo, em seguida depositou-se o disco nas micro-lesões e vedou-se com filme plástico. Após a inoculação, o material permaneceu por tempo mínimo de 24 horas em câmara úmida.

O segundo método realizado foi por suspensão conidial, para isso utilizou-se novamente uma agulha para realizar as micro-lesões nas folhas. Em seguida, pulverizou-se os conídios do patógeno, com auxílio de um spray. Após a inoculação, as plantas permaneceram por tempo mínimo de 24 horas em câmara úmida.

Foi feito também uma planta de pimenta de cheiro aspergida apenas com água, mantendo assim, como as demais em câmara úmida, para servir como testemunha.

Repicagem de fungos: outra técnica aprendida em meu ESO foi como fazer a manutenção de fungos por meio da repicagem. Nesta técnica, em geral, deve-se transferir apenas as porções da colônia nova dos fungos.

Durante o período do estágio, realizei a repicagem dos seguintes fungos de hortaliças: pimenta malagueta, gênero Colletotrichum; manjericão, gênero Fusarium; tomate, gênero Colletotrichum; pepino, gênero Colletotrichum e Pythium; pimenta de cheiro, gênero Colletotrichum; e cebolinha, gênero Colletotrichum.

O procedimento começa com a esterilização das alças e pinças em álcool 70 %, sendo em seguida flambadas por duas vezes até o ponto de incandescência. Feito isso, faz-se quadradinhos com a ajuda da alça na região onde ouve crescimento do fungo (Figura 4 A), vale ressaltar a importância de se retirar discos de regiões diferentes da placa. Em seguida coloca-se os quadradinhos retirados em nova placa de petri com meio BDA. As placas novas com os fungos são então vedadas com filme plástico e identificadas (Figura 4B).

Figura 4. A: Marcação e identificação de onde houve crescimento fúngico. B: Fungos repicados em meio meio BDA.

Preservação de fungos: os métodos de preservação de fungos normalmente utilizados no laboratório são: Castellanni, glicerina e óleo mineral. Existe outros métodos como nitrogênio líquido, semente e etc. Foram preservados os isolados fúngicos do gênero Colletotrichum spp. e Pythium, utilizando o método Castellanni, que consiste em uma preservação em água.

Para preservação utilizando este método, adicionou-se 1,5 ml de água destilada estéril em cada tubo, com ajuda de uma alça colocou-se cinco discos em cada, sendo em seguida vedados e identificados os respectivos tubos.

Foram realizados também, a reativação de fungos da micoteca em método Castellani e óleo mineral. Os fungos reativados no método Castellani foram os fungos identificados como CA 10, CA 11, CA, 12, CA 13, CA 14, CA 15.

Primeiro foi adicionado água destilada em cada frasco. Com o perfurador formou-se os discos e com o cabo de kolle colocou-se cinco discos em cada frasco. Logo após, os frascos foram vedados e identificados.

No método com óleo mineral foram reativados os fungos identificados como CT1, CT3, CT4, CT5, CT7 E CT 8. Após a assepsia do material, foram separados cinco tubos com meios de cultura para cada placa com fungo. Com o perfurador foram retirados os discos, colocados em cada tubo com auxílio do cabo de kolle, e ao final, foram vedados e identificados, e posteriormente coberto as colônias com óleo mineral esterilizado.

Extração de ácidos nucléicos de vírus: outra atividade que também pude acompanhar foi a extração de ácidos nucleicos, usando o protocolo de Gibbs e Mackenzie (1997) para as seguintes amostras (Tabela 1).

Tabela 1. Amostras de hortaliças folhosas e leguminosas de diferentes localidades do Pará.

Hortaliças Localidade

Jambu- hidropônico Ananindeua

Alfavaca-Mosaico Castanhal

Alfavaca-planta pequena Castanhal

Feijão de metro –Tanang’s Terra alta

Feijão de metro -Cp74 Terra alta

Feijão de metro amostra 3 Terra Alta

Feijão de metro amostra 4 Terra Alta

Chicórias Formosa

Jambu Curuçambá-Ananindeua

O protocolo de extração de ácidos nucléicos varia conforme o organismo a ser extraído. A diferença da extração de vírus para fungo é que, para vírus usa-se o mercaptoetanol, e para fungos usa-se nitrogênio líquido, para que ocorra a quebra da parede celular.

Analise de teste molecular (PCR): O PCR realizado no laboratório de fitopatologia, é utilizado para identificar e caracterizar microrganismos causadores de doenças em plantas. Durante o estágio pude fazer PCR de vírus, e acompanhar PCR para fungos.

O preparo para a reação de PCR foi realizada para um volume final de 50 µL, onde foram adicionados 2 µL de produto de extração de DNA, 0,5 µL de cada primer (CPR e CP), 0,3µL de Taq, 1µL de dNTP, 5µL Tampão 10X, 6µL de MgCl2 e água ultrapura para completar o volume do mix.

A amplificação foi conduzida em termociclador. Onde as amostras