A Espectrofotometria

...

Experimentação:

Instrumentação

- Espectrofotômetro UV-vis modelo Tu-1810

- Leitor de microplaca de 96 poços

- 4 Pedaços de filtro (405, 450, 490, 630 nm)

- Banho d’água

- Agitador de vórtice

- Maquina centrifuga

Reagentes

- 200 ug/mL de nitrito dissolvendo 300mg de nitrito de sódio

- Diluição apropriada das soluções

- Solução de 10mg/mL de ácido sulfanilico dissolvendo 100mg de 1 – niftalina em 100mL de mentanol (50%)

- Triton X-114 (10%) diluído em 11,1 mL de Triton X-114 (90%) em um balão volumétrico de 100 mL

OBS: Todos os produtos químicos utilizados eram de grau analítico e dupla agua destilada foi utilizada em todos.

Preparação de amostra de urina e sangue:

Amostra de sangue total

As amostras de sangue total (5mL) foram retiradas de 10 voluntários da China. O plasma da camada superior foi transferido para um novo tubo, as amostras foram centrifugadas a 2000 rpm por 10 min. O plasma foi tanto utilizado para a análise imediata de nitrito ou armazenados a – 20 ºC até a análise. A proteína precipitante e o descolorante de 400 uL de NaOH (2,0 M) e 0,4 g de ZnSO4 foram adicionados num tubo de centrífuga de 10 mL com 2 ml de plasma. A mistura foi misturada no vórtice por 30 s, e depositados por centrifugação á 5000 rpm por 10 min. O sobrenadante límpido e incolor foi então transferido para um novo tubo, e 200 uL da solução de ácido sulfanílico (10 mg mL-1) e 200uL de solução de 1-naftilamina (1 mg mL-1) foi adicionada. A solução foi misturada completamente e diluída até ao volume de 5 ml com água destilada para análise posterior de acordo com o procedimento de CPE.

Amostra de Urina

As amostras de urina foram coletadas dos mesmos 10 voluntários usando polímero propeno (PP). Todas as amostras foram utilizadas tanto para alise imediata ou pra armazenados para futuras analises. 0,4 g de carbono ativo utilizado como agente de descoloração foi adicionado em um tubo de centrífuga de 10 mL com 5 mL de amostra de urina, seguido de uma mistura por 30 s. A amostra de urina foi filtrada com um pedaço de papel de filtro e recolhidos com um novo tubo, em seguida, 200 uL de solução de ácido sulfanílico (mg/mL -1) e 200 uL de solução de 1-naftilamina foram adicionados. A solução foi misturada completamente e diluída no volume de 5 mL com água destilada para análise de acordo com o procedimento de CPE.

Procedimento de extração por ponto nuvem

As soluções de pré-amostra tratada (5 mL) contendo derivado de nitrito foi colocada num tubo de vidro com tampa de rosca de 10 ml. Em seguida, 400 ul de Triton X- 114 solução (10%) e 0,2 g de (NH4) 2SO foi adicionado para a solução da amostra. Uma mistura da amostra, sal e agente tensioactivo (Triton X -114) foi agitada durante 30s ,após isto posto em repouso a 40ºC, opacificação foi terminada por centrifugação a 4000 rpm durante 10 min. A fase aquosa foi removida e a fase rica em surfactante foi depositada no fundo do tubo. O volume de fase de enriquecimento (200 + 10uL) foi medida por uma seringa graduada. A fase de agente tensioactivo foi removida com uma pipeta e consecutivamente colocado nos orifícios microscópicos e a absorvância foi medida a 490 nm contra o branco. A solução branca também foi executado sob o mesmo procedimento sem a adição de qualquer nitrito.

Resultados e discussões

Descoloração e procedimento de extração de ponto de nuvem, foram desenvolvidos para a separação e pré-conceituação de nitrito na urina e no plasma, tal como mostrado na figura 1.

Fig. 1. O procedimento de processamento da amostra (A) 5 mL de urina foi enriquecida com 100 ng mL -1 de nitrito, (B) a urina foi descolorada; (C) depois da reação de Griess, (D) uma mistura turva foi formado e (E) a separação de fases após centrifugação. [pic 1]

Seleção de comprimento de onda de detecção:

Este método é baseado na reação de nitrito com ácido sulfanílico e 1-naftilamina, a formação de um corante com aro vermelho que é detectável por espectrofotometria, como mostrado na figura 2.

Fig.2. reação de Griess, o íon nitrito reage com sulfanilamida em meio ácido para se obter um derivado de diazônio, este reagente intermediário vai interagir com 1-naftilamina, para se obter um produto diazo colorido. [pic 2]

Os espectros de absorvância de visível soluções foram registados na gama de 400-650 nm, como se vê na figura 3.

Fig.3. Espectro de absorvência visível (1) o reagente em branco (2) amostra de urina original (3) amostra de plasma inicial (4) o produto da reação de Griess, na presença de 100 ng ml^-1 de nitrito (5) o produto da reação de Griess, na presença de 100 ng ml^-1 de nitrito com o procedimento de CPE. [pic 3]

Combinando com comprimentos de onda de detecção do leitor de Microplacas tem por escolhas de 405, 450, 490,630, 690 nm foi seletor medição da absorvância da fase.

Seleção do agente descolorante em urina:

Para utilizar o método de seleção do agente descolorante, antes terá que ser feita a detecção colorimétrica, que tem a desvantagem de interferência de outros cromóforos em amostras biológicas. Portanto, para evitar a interferência de outros cromóforos é aconselhável a descoloração das amostras biológicas antes da medição, que também irá aumentar largamente a sensibilidade analítica. Mesmo que a diluição simples da matriz de cor seja realizada, é improvável que o nitrito possa ser detectado com sucesso, já que está geralmente presente em amostras biológicas, em quantidades muito baixas. De todos os avaliados (Chitosan, Keselguhr, sepiolite e carvão ativado), o de carvão ativo 0,2g foi a melhor opção para descolorir amostras de urina humana (como mostra a figura 4). Quando a cor da urina foi removida a concentração de nitrito das amostras não foi reduzida.

Fig.4.