UBIQUIDADE MICROBIANA INOCULAÇÃO MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM

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placas de Petri e os meios de cultura, foram manuseados dentro desta com radiação de luz UV e fluxo de ar laminar porá evitar contaminação pelo ar e pelo analista da amostra, foi deixado por aproximadamente 15 minutos sem interferência para se realizar a descontaminação.

Após esse tempo, higieniza-se as mãos e a bancada com álcool 70% e acede-se a chama do bico de Bunsen, para criar um ambiente menos propenso a contaminação, então verte-se os meios de cultura nas placas de Petri o mais próximo da chama possível e evitando a fala ou qualquer ato que possa ocasionar contaminação ao meio. Utilizando 10 placas contendo PCA e 10 contendo BDA, aguardando-se até a secagem das mesmas. Como mostra figura abaixo.

Figura 3: Preparo das soluções em placas de Petri.

Fonte: Os autores.

Após secas e em temperatura ambiente , as placas foram agrupadas e envoltas em um filme plástico, e armazenadas sob refrigeração controlada (5±3ºC) por uma semana.

2.4 INOCULAÇÃO (Etapa-3)

Escolhe-se dois lugares para realizar a pesquisa dos micro-organismos no ar, estes f locais foram: a cantina do campus 2 da FURB e o banheiro do terceiro andar do bloco I da FURB. No local preestabelecido foi posicionado duas placas de Petri contendo cada uma um tipo de meio( PCA e BDA) e ali foram abertas e deixadas pelo tempo de 15 minutos.

Para a pesquisa de micro-organismo em objeto utilizou-se 3 objetos, sendo eles: um brinco, um anel e chave. Colocou-se o objeto dentro da placa e manteve-se lá pelo tempo de 15 minutos. Após este tempo retirou-se o objeto evitando qualquer contaminação por outro meio a não ser o objeto em estudo e identificou-se cada placa com o tipo de meio, equipe e objeto.

As placas com BDA foram posicionadas não invertidas em estufa à 25ºC, já as placas com PCA foram incubadas em posição invertida a uma temperatura de 35ºC, esta posição se deve para evitar que o condensado pingue encima do meio. As mesmas permaneceram acondicionadas em ambiente controlado por um período de uma semana.

A figura 4 elucida algumas características para identificação de colônias, em forma, tipo de elevação, e margem.

Figura 4: Formas caraterísticas para identificação de colônias.

Fonte: Disponível em www.ebah.com.br. Acesso em 19/09/16.

2.5 TÉCNICA DO ESFREGAÇO DE SUPERFÍCIE COM SWAB

Preparando o SWAB, hastes de madeira com algodão na ponta e também moldes alumínio para a análise microbiológica em superfícies, técnica essa denominada esfregaço. Para a esterilização foi empregado o método com autoclave, seguindo a mesma linha anteriormente aplicada.

Para esta técnica preparou-se a água Peptonada. Seguindo o procedimento de preparo desta solução com a composição previamente definidas dos seguintes compostos: NaCl, Peptona e Água destilada. Após o preparo da solução preencheu-se 5 tubos de ensaio, com um volume de 10 ml em 3 tubos e os outros 2 tubos com um volume de 9 ml, para posterior diluição.

A maneira que o swab é aplicado sobre a superfície para a coleta das amostras é muito importante. Movimentos padronizados do swab na área determinada no molde garantem que se obtenha uma coleta uniforme de amostra para análise. A figura 5 ilustra como pode ser realizada esta coleta adequadamente.

Figura 5: Técnica de coleta para Swab.

Fonte: Disponível em www.cmscientifica.com.br. Acesso em 19/09/16.

Assim, foram escolhidos 3 lugares para aplicar a pesquisa de micro-organismo em superfície, sendo estes: o botão do elevador do campus 2, bloco I da FURB, capa de celular e tampa do vaso sanitário feminino do bloco I, campus 2 da FURB.

Para a realização do ensaio inicia-se abrindo o frasco e em seguida mergulha-se o Swab na água Peptonada e retira-se o excesso rodando o Swab dentro do frasco. Posiciona-se o molde de determinação de área e com movimentos verticais por todo o espaço do molde e logo movimentos horizontais e ainda com movimentos em rotação da haste para garantir a coleta da amostra e para que toda a área do molde seja esfregada, logo após o término de esfregaço, coloca-se a haste (Swab) dentro do tubo de ensaio de 10 ml e o fecha.

Para o teste de diluição escolheu-se o tubo de ensaio contendo a análise do botão do elevador e foram realizadas duas diluições. As diluições foram feitas removendo 1ml do tubo de ensaio onde foi adicionado o Swab e adicionando essa alíquota a um segundo tubo de ensaio que continha 9ml de solução Peptonada, agitou-se a amostra para a homogeneização completa, em seguida feito o mesmo procedimento só que removendo uma alíquota de 1ml do segundo tubo já diluído, assim formando as diluições e respectivamente.

De cada tubo de ensaio retira-se 0,1 ml e pipetado sobre uma placa de Petri contendo PCA e uma BDA.

As figuras a seguir referem-se a algumas dessas placas descritas anteriormente.

Figura 6: Banheiro feminino – Análise de bactéria no ar.

Fonte: Os autores.

Figura 7: Brinco – Análise de bactéria em objeto.

Fonte: Os autores.

Figura 8: Banheiro feminino – Análise de bolores e leveduras no ar.

Fonte: Os autores.

Figura 9: Brinco – Análise de mofo e levedura em objeto.

Fonte: Os autores.

2.6 COLORAÇÃO DE GRAM (Etapa-4)

Com este método consegue-se distinguir por diferença da composição química das paredes das bactérias, dois grupos sendo eles, Gram positivas (+) e Gram negativas (-).

Para a composição dos corantes.

• Solução de cristal violeta, usa-se duas soluções: Solução A (Cristal violeta 2g mais Etanol e Acetona 20ml e para a solução B (Oxalato de