Trabalho oficial lâmina permanente

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- COLETA DOS TECIDOS

Após a eutanásia, foi feita a dissecação e o estudo da anatomia comparada pelo técnico do laboratório de anatomia Raimundo, juntamente com os alunos. Em seguida, foi realizada a remoção das partes dos órgãos ou tecidos (fígado, baço, tireoide, rins, nervos, bexiga, intestino, ovários, testículos, pele, pulmão e outros) com o auxilio de bisturi e pinça de maneira cautelosa inicialmente pela professora responsável, Niviane Fraga, e em seguida pelos alunos. Os tecidos ou órgãos foram cortados e subdivididos em pequenos fragmentos, orientando-se os cortes de subdivisão de maneira a estabelecer planos segundo os quais foram feitas as seções de corte.

O descarte do restante do material biológico, após a coleta dos tecidos para preparação de lâminas, será encaminhado ao biotério central do INPA que destinará apropriadamente tais resíduos de acordo com as normas sanitárias e de biossegurança vigentes.

- FIXAÇÃO

É a primeira etapa e tem as seguintes finalidades: evitar a autólise; impedir a atividade e proliferação de bactérias; endurecer as células para que resistam melhor às etapas seguintes da técnica citológica e aumentar a afinidade das estruturas pelos corantes, facilitando a coloração.

Utiliza-se formol (formaldeído a 10%). Esta substância tem como característica evitar o processo de autólise da célula, preservar o material biológico in vitro, impedir a destruição do tecido por procariontes, endurecer o material para melhor tratamento posterior e aumentar a capacidade de coloração do material. O tempo de fixação pode variar entre 12 e 72 horas, dependendo do material a ser processado.

4. DESIDRATAÇÃO

A desidratação do material será realizada a partir de uma sequencia crescente de álcool etílico de 70% a 100%, permanecendo uma hora em cada etapa com o objetivo de remover a água dos tecidos, nas concentrações de 1:1, de 1:2 e de 1:3.

5. DIAFANIZAÇÃO

A impregnação do tecido com meio de inclusão é impossível nesse estágio porque as substâncias semelhantes à parafina usadas para a inclusão não se misturam com o álcool. O tecido deve, portanto, ser imerso em um produto químico e que o álcool e a parafina sejam solúveis. Assim a diafanização consiste na infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina não se mistura com água e nem com álcool. Ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. O xilol é comumente utilizado. Tal produto químico é muitas vezes chamado de agente clarificador porque torna o tecido semi-translúcido, quase transparente. Entre os reagentes mais utilizados na fase de diafanização podemos citar ainda: toluol, clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de metila.

A quantidade de xilol (substância mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o volume da peça. A duração da clarificação varia com as dimensões, a constituição do material e a temperatura.

6. INCLUSÃO

Neste passo realizaremos a inclusão do material na parafina pelo seguinte modo, colocamos a parafina no cadinho juntamente com um pedaço de cera de abelha, aquecemos a 60º C.

O material biológico é colocado em um recipiente adequado (molde) no qual adicionamos parafina fundida ate ficar completamente infiltrado. Utiliza-se Xilol para permitir melhor a penetração de parafina na peça. Uma vez a parafina resfriada, irá formar blocos de parafina com o material biológico nele.

7. MICROTOMIA

Esta etapa consiste basicamente em utilizar o micrótomo para obter cortes sucessivos delgados e uniformes, a partir dos blocos de parafina com as pecas incluídas. Este aparelho e formado por uma lamina de aço, afiada, e o braço ao qual se prender o bloco e que se desloca verticalmente. Os cortes serão cortados com espessura de 4 a 5 micrometros. As fitas de corte de parafina são estiradas cuidadosamente, e os cortes individuais separados por um bisturi. Na superfície de uma lamina de vidro e feito um ponto de aderência esfregando com uma solução fraca de albumina de ovo. Em seguida uma pequena quantidade de água e colocado sobre a lâmina e um corte único e posto a flutuar. Para garantir a aderência, a lamina e colocada para secar em uma estufa a 37ºC

8. COLORAÇÃO E MONTAGEM DAS LAMINAS HISTOLOGICAS

Quase todas as organelas e estruturas celulares são transparentes e incolores. Para resolver esta questão foram criadas numerosas técnicas de coloração, pois não existe uma técnica que sozinha evidencie todas as estruturas celulares, já que a constituição química destas estruturas é bastante variável. Diversos preparados com sentidos de cortes e colorações diferenciadas devem ser feitos para se conhecer e evidenciar todos os constituintes celulares.

Esse procedimento foi executado a partir do uso sucessivo de xilol e álcool através dos seguintes passos:

a – Desparafinar em xilol durante 3 minutos (duas trocas)

b – Hidratar em álcool.

c – Imersão em álcool absoluto 100% (3 trocas)

d – Imersão em álcool absoluto 90% (1 troca)

e– Imersão em álcool absoluto 70% (1 troca)

f – Corar pela hematoxilina (corante básico) durante 5 min.

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