Variante moleculares do vírus da influenza
Por: Lidieisa • 27/1/2018 • 21.113 Palavras (85 Páginas) • 434 Visualizações
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Dr. Marcelo Genofre Vallada, pela seleção dos paciêntes e coleta
das amostras no Instituto da Criança da FMUSP.
Ao Alexandre Pereira pelo acompanhamento deste trabalho.
A Dra Viviane Botosso por todas as sugestões dadas para a conclusão
deste trabalho.
A Dra Rita de Cassia Stocco dos Santos por todo apoio e ajuda
dispensada a mim.
A Leonardo Setsuo Kobashi pela ajuda na finalização do trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Virologia, em especial para Jansen de
Araújo pelo apoio nos experimentos de conclusão desta Dissertação.
A Nair Aparecida da Silva Pereira, pelo apoio prestado durante a
execução deste trabalho e pelo incentivo dado em todos os momentos.
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A Antônio Carlos de Freitas também pelo apoio e incentivo.
Aos amigos e também alunos do laboratório de genética: Marcelo M.
Tavares, Luis G. B. Goes, Luciana S. Cabral, Gil R. H. Ribeiro, Rodrigo F.
Ramalho, Guilherme Francisco, Juliana S. Capitanio, Adriana M. Orimoto e
Daniela C. C. Santos.
Em especial a Olga Brunner pelo convívio desde o início, mesmo antes
de eu ser aluno do curso de mestrado.
Aos fúncionários e também amigos do laboratório de Genética do
Instituto Butantan; Zenaide L. Silva, Vera L. A. Rodrigues, Tânia R. Berulis,
Ivone S. dos Santos, Laerte P. do Santos, Ronaldo Dias, Helir Serralvo.
Aos funcionários da Pós-Graduação por toda ajuda dispensada.
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Índice
I - Introdução...................................................................................................01
II - Objetivos....................................................................................................18
III - Materiais e Métodos
1.Amostras.............................................................................................19
2.Extração de RNA................................................................................19
3. Obtenção de cDNAs por transcrição reversa.....................................20
4. Reação em Cadeia pela Polimerase -“Nested Multiplex PCR”.........21
4.1. Oligonucleotídeos Iniciadores (primers)..............................21
4.2. Reações.................................................................................23
4.3. Análise dos Produtos Amplificados......................................25
5. Reações de “Semi-Nested PCR” e “Nested-PCR".............................25
5.1. Oligonucleotídeos iniciadores..............................................25
5.2. Reações.................................................................................30
5.3. Análise dos Produtos Amplificados......................................32
6. Determinação da seqüência de nucleotídeos......................................32
6.1. Purificação dos Produtos de PCR.........................................33
6.2. Reação de determinação de Seqüências de nucleotídeos......33
7. Edição e Análise das Seqüências Obtidas..........................................35
8. Localização das diferenças na estrutura da hemaglutinina................35
9. Árvore genealógica............................................................................36
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IV - Resultados.................................................................................................37
1. Detecção, tipagem e subtipagem das amostras clínicas.....................37
2. Obtenção da região codificadora completa de HA1..........................40
3. Nested e Semi-nested PCR................................................................40
4. Seqüências de aminoácidos de HA1 das amostras estudadas:
análise comparativa das amostras entre si e com as cepas vacinais...42
4.1. Tipo A Subtipo H1N1...........................................................42
4.2. Tipo A Subtipo H3N2...........................................................49
4.3. Tipo B...................................................................................59
4.4. Pesquisa das seqüências de nucleotídeos no "Genbank"......63
4.5. Pesquisa no "Genbank" das seqüências de A H1N1.............64
4.6. Pesquisa no "Genbank" das seqüências de A H3N2.............65
4.7. Pesquisa no "Genbank" das seqüências de vírus do tipo B..66
4.8. Árvore Genealógica..............................................................66
V - Discussão...................................................................................................70
VI - Conclusão.................................................................................................81
VII - Resumo....................................................................................................82
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