COLORAÇÃO DE ESFREGAÇO DE MATERIAL BIOLÓGICO PELO MÉTODO DE GRAM

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Cada indivíduo pegou, então, um cotonete, friccionou sobre a gengiva e esfregou suavemente, de forma circular, sobre a parte que lhe cabia da lâmina, contrária a marcação, coletando amostras de sulco gengival. Após o esfregaço secar naturalmente, passou-se a fixação do material à lâmina, como descrito a seguir.

Fixação

Esta fase foi executada passando-se a face da lâmina oposta ao esfregaço sobre a ponta da chama por 3x, rapidamente, para que ficasse levemente aquecida, sem tostar os possíveis micróbios contidos na amostra.

Etapa 2

Etapa de coloração primária do material

Finalidade: corar a amostra com a cor violeta

- Colocação da lâmina, com o esfregaço voltado para cima, em um suporte nivelado de modo a reter líquidos em sua superfície;

- Cobertura de todo o esfregaço com gotas de cristal violeta;

- Repouso de 1 min para corar a amostra;

- Descarte do corante violeta de sobre a lâmina dentro do pote de sorvete;

- Colocação da lâmina novamente no suporte nivelado, com o esfregaço voltado para cima;

- Cobertura de todo o esfregaço com gotas de Lugol (fixador de iodo);

- Repouso de mais 1 min para reação entre as soluções;

- Descarte do Lugol de sobre a lâmina dentro do pote de sorvete;

- Lavagem rápida do esfregaço com gotas de álcool (pipeta pasteur), mantendo-se a lâmina inclinada sobre o pote de sorvete;

- Lavagem do esfregaço com jatos de água da pisseta, mantendo-se a lâmina inclinada sobre o pote de sorvete;

- Aparar, rapidamente, a lâmina inclinada sobre um pedaço de papel higiênico para escorrer o excesso de água;

- Observação da amostra, procurando visualizar células bacterianas coloridas em violeta e/ou descoradas.

Etapa 3

Etapa de coloração secundária ou de contraste

Finalidade: corar de vermelho as células que ficaram descoradas na primeira etapa de coloração, para obter contraste e evidenciar as diferenças.

- Colocação da lâmina, com o esfregaço corado voltado para cima, em um suporte nivelado de modo a reter líquidos em sua superfície;

- Cobertura de todo o esfregaço com gotas de fucsina;

- Repouso de de 30 seg para corar amostra com a fucsina;

- Descarte do corante fucsina de sobre a lâmina dentro do pote de sorvete;

- Lavagem do esfregaço com jatos de água da pisseta, mantendo a lâmina inclinada sobre o pote de sorvete;

- Aparar, rapidamente, a lâmina inclinada sobre um pedaço de papel higiênico para escorrer o excesso de água;

- Colocação da lâmina no suporte, com o esfregaço voltado para cima, para secar naturalmente.

Etapa 4

Etapa de preparação para observação microscópica

Finalidade: controlar a propagação da luz que incidirá na lâmina para garantir a qualidade da visualização dos resultados ao microscópio.

- Após rápida secagem foi colocada uma gota de óleo mineral sobre a lâmina.

Etapa 5

Observação ao microscópio

- Levar a lâmina preparada com o óleo mineral ao microscópio óptico digital acoplado ao notebook e ao projetor;

- Observação da amostra ampliando gradativamente a imagem.

Etapa 6

Análise e discussão dos resultados

- Análise da amostra;

- Levantamento de hipóteses sobre os resultados;

- Discussão dos resultados;

- Tentar fechar conclusões embasadas em conhecimento obtido previamente em levantamento bibliográfico ou consulta ao tutor presencial.

FENÔMENOS FÍSICOS-QUÍMICOS

- O álcool possui atividade desengordurante e desinfetante sobre a lâmina que vai receber o material a ser analisado.

- Em nossa cavidade bucal existem muitos micróbios. Por isto, e pela praticidade de coleta, a opção por amostras de sulco gengival, onde mais se concentram estes microrganismos.

- O esfregaço, pequena amostra da matéria orgânica depositada sobre a lâmina microscópica, pôde ser foi obtido através da técnica de Swab (uso de haste flexível de algodão estéril).

- Pronto o esfregaço, passou-se a lâmina rapidamente, por 3 vezes, sobre a lamparina, para fixar-se o material, tomando-se o cuidado para não tostar possíveis microrganismos ali contidos, o que inviabilizaria a experiência. A lâmina foi apenas levemente aquecida, para que o material ficasse dessecado, endurecido, porém preservado.

- Passou-se então, às fases de coloração e descoloração, propriamente ditas, com o uso de substâncias químicas de princípios diferentes.

- O corante cristal violeta, por sua característica hidrofílica, ao ser colocado para reagir sobre a amostra, cora de violeta todo o conteúdo das células, independente de possíveis diferenças estruturais entre elas (observação a olho nu no experimento em questão).

- O Lugol, usado em seguida como fixador da coloração, ao reagir com o cristal violeta, passa a formar o composto iodo-para-rosanilina, de caráter hidrofóbio, não solúvel em água, e melhor dissolvido em lipídeos.

- A lavagem com o álcool, solvente lipídico, consegue descorar as células que possuem membranas externas mais finas e menos complexas. As que apresentam membranas externas mais espessas, rígidas e complexas não são permeadas pelo álcool, mantendo sua coloração violeta e paredes ainda mais resistentes devido a dessecação provocada.