Produção de Antígeno Quimérico Recombinante em Biorreator e Aplicação da Eletroforese Capilar e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para sua Quantificação

Produção de proteina Recombinante e Aplicação da Eletroforese Capilar e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para sua Quantificação

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA BIOQUÍMICO-FARMACÊUTICA

Produção de Antígeno Quimérico Recombinante em Biorreator e Aplicação da Eletroforese Capilar e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para sua Quantificação

Relatório parcial Iniciação científica

Conselho Nacional de Pesquisa e desenvolvimento científico (CNPq)

Agosto 2013- Fevereiro 2014

Bolsista: Juan Carlos Flores Santos

Orientador: Adalberto Pessoa Junior

Bolsa: PIBIC

São Paulo 2014

RESUMO

SANTOS, F. J. C. Produção de Antígeno Quimérico Recombinante em Biorreator e Aplicação da Eletroforese Capilar e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para sua Quantificação. 2013.

Relatório parcial de Iniciação científica - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo – Brasil.

A malária é uma das mais relevantes doenças tropicais, o Plasmodium vivax é um dos seus agentes etológicos e atualmente encontra-se como a segunda espécie mais prevalente. Nas Américas, o P. vivax é a espécie mais prevalente sendo responsável por mais de 70% dos casos de malária. Devido a rápida disseminação do parasita, o aumento da resistência aos fármacos e a inseticida, novas ferramentas para o controle da malária, como por exemplo vacinas, são urgentemente necessárias. Neste sentido, o antígeno de membrana apical (AMA1) e a proteína de superfície do merosoíta (MSP1) de P. vivax são candidatos atraentes como antígenos vacinais já que apresentam elevada reatividade e imunogenicidade. A levedura metilotrófica Pichia pastoris está sendo utilizada para expressar o antígeno quimérico (pv-AMA1dI-II-MSP119-His6) que está sendo empregado na vacinação experimental em animais contra o P. vivax. No entanto para avançar nos processos de produção e purificação desta proteína necessita-se de uma técnica analítica (simples, rápida, precisa e confiável) para quantificação desta proteína. Em função disto, neste documento tem a finalidade de desenvolver uma metodologia de análise quantitativa empregando as técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e eletroforese capilar (CE) para determinação do antígeno quimérico produzido por P. pastoris recombinante em biorreator.

Palavras-chave: Arthrospira (Spirulina) platensis, carvão ativado granular, sulfato férrico.

1. INTRODUÇÃO

A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium, cinco espécies infectam naturalmente o homem: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e a recentemente P. knowlesi (LUCHAVEZ; ESPINO; CURAMENG, 2008). No Brasil, é causada por três espécies: P. vivax, P. falciparum e P. malariae(SVS/MINISTERIO DA SAUDE, 2013). O Brasil registra uma alta porcentagem de casos de malária relacionada com P. vivax (83,7%) (SVS/MINISTERIO DA SAUDE, 2013), isto coloca o país como um dos poucos no mundo com predominância desta espécie(WHO, 2010; WHO,2012).

A infecção pelo P. vivax, apesar de provocar febre, geralmente apresenta-se como uma doença benigna(OLIVEIRA-FERREIRA, 2010). No entanto, nos últimos anos têm sido relatadas complicações clínicas incomuns, com casos fatais. Este fato chama atenção para o desenvolvimento de nossas ferramentas para controle do vetor assim como a necessidade de novos fármacos e vacinas contra o parasita (MENDIS;MARCHENSINI; CARTER,2001 & GALINSKI; BAMWELLI, 2008). Em relação as vacinas, uma série de abordagens experimentais começaram a ser investigadas (HOLFFMANN, 1996), entretanto até o momento ainda não existe nenhuma vacina aprovada contra o P. vivax.

Várias proteínas já foram identificadas e utilizadas em formulações para indução de proteção contra o P. vivax entre elas estão o Antígeno de Membrana Apical-1 (AMA1) e a Proteína de Superfície do Merosoíta-1 (MSP1)(STOWERS, 2008; KUMAR, ET AL, 2008; BUENO, ET. AL, 2008). Ambas são componentes essenciais do merosoíta na fase assexual sanguínea, responsável pela invasão dos eritrócitos/reticulócitos. Também estão presentes em merosoitas que emergem de células hepáticas infectadas e assim como AMA1 também já foi identificada como uma protena de esporozoíto(HODDER; CREWTHER;ANDERS,2001 & FREEMAN; HOLDER, 1983). Outra estratégia promissora é a utilização de antígenos quiméricos das duas proteínas, esta abordagem já foi utilizada com sucesso para AMA1 e MSP1 de P. fauciparum(PENG;ET AL, 2010, HU;ET AL,2008, FABER; ET AL, 2007), e atualmente esta vacina encontra-se em estudos de fase clínica-I(HU, ET AL, 2008).

A levedura metilotrófica Pichia pastoris está sendo utilizada para expressão da proteína pv-AMA1dI-II-MSP119-His6, uma quimera que possui regiões imunodominantes das proteínas AMA-1 e MSP-1 de P. vivax ligada a cauda de hexa-histidina(FRANÇOSO S, 2012). A reatividade e resposta imunológica experimental faz deste antígeno quimérico um candidato importante para o desenvolvimento de uma vacina contra P. vivax, entretanto, existem limitações para a obtenção desta proteína em quantidade suficiente para prosseguir os testes pré-clínicos. (FRANÇOSO S, 2012)

Uma das limitações é a produção em pequena escala e outra é a falta de um método analítico para quantificação desta proteína. A obtenção de proteínas recombinantes em leveduras envolve basicamente o cultivo submerso e processos de purificação.(FABER, ET AL, 2008; MARTENS, ET. AL 2011) Para monitorar estas etapas é necessária uma metodologia analítica de quantificação da biomolécula, assim é possível avaliar e controlar as condições operacionais.

Nosso interesse na proteína pv-AMA1dI-II-MSP119-His6 está em iniciar os estudos de produção em biorreator e desenvolver metodologias de quantificação