PURIFICAÇÃO DA LISOZIMA A PARTIR DA CLARA DE OVO EM DIFERENTES DILUIÇÕES UTILIZANDO TROCADOR CATIÔNICO MONOLÍTICO POLIMÉRICO SUPERMACROPOROSO

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2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Material

Para a realização deste trabalho foram utilizados ovos brancos frescos de galinha, tipo grande, adquiridos de produtores registrados no comércio local. Fosfatos de sódio monobásico e bibásico, ambos anidros, e cloreto de sódio foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA), assim como os padrões de lisozima (pureza > 90%, código L6876), conalbumina (código C0755) e albumina (A5378). Todos os reagentes químicos utilizados possuíam, no mínimo, grau de pureza PAACS. Em todos os experimentos foi utilizada água deionizada ultra-pura. O teor de proteína do padrão de lisozima foi avaliado pelo método de Kjeldhal (Chang, 1999), utilizando-se um fator de conversão igual a 6,25. Para a purificação da lisozima foi utilizada coluna cromatográfica C10/20 com pistão adaptador AC10 (ambos da GE Healthcare, Uppsala, Suécia), de modo que o leito monolítico apresentou 9,4 cm de comprimento e 1,0 cm de diâmetro. O trocador catiônico utilizado como monólito foi criogel polimérico constituído por acrilamida, bis-acrilamida e alil glicidil éter, enxertado com o ácido 2-acrilamido-2- metil-1-propanossulfônico (criogel pAAm-SO3), sintetizado no próprio laboratório. Algumas características físicas e químicas do leito trocador catiônico utilizado são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1: Características do leito monolítico trocador catiônico utilizado.

Característica do adsorvente

Valor

Comprimento (L) / (cm)

9,4

Diâmetro total (D) / (cm)

1,0

Permeabilidade ao escoamento (kp) / (m²)

8,47x10-13

Porosidade total (εt)

0,91

Porosidade aparente com lisozima (εap)

0,83

Altura equivalente a um prato teórico (HETP) / (mm)

2,3

Diâmetro médio de poro (dm) / (μm)

70

Cap. Iônica volumétrica (Λ) / (10-3 molNa+.L-1criog. hidrat)

25,72

2.2. Preparo das soluções de alimentação

Para a extração da lisozima da clara do ovo foi feito um pré-tratamento para percolar o leito monolítico similar ao realizado por Guérin-Dubiard et al. (2005), 119 Yan et al. (2011), com algumas modificações. Tal tratamento visou retirar a proteína ovomucina presente na clara, a principal responsável pela consistência gelatinosa da mesma (Omana et al., 2010). Para tanto, procedeu-se à separação manual da clara, que foi colocada sobre uma peneira plástica com diâmetro total de 5,0 cm e malha com abertura de 1,0 mm, deixando-se a parte fina da clara se separar da parte viscosa e da chalaza por ação da força da gravidade. Tal procedimento foi repetido com quinze ovos, obtendo-se cerca de 190 mL de clara fina. A clara pré-tratada foi diluída com dois volumes (~380 mL) de água deionizada, teve o pH da mistura ajustado para 6,0 utilizando-se uma solução de HCl 2,0 mol⋅L-1 e foi então levada à agitação orbital a 25 rpm em tubos de centrífuga de 15 mL em uma estufa BOD (Modelo EL101/3, Eletrolab, São Paulo, Brasil) mantida à temperatura (2,0 ± 0,3) °C por cerca de 12 h (overnight). Em seguida os tubos foram centrifugados sob refrigeração (4 °C) à rotação de 12000 × g durante 10 min em uma centrífuga de bancada com rotor de ângulo fixo (Modelo 5804R, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) sendo o sobrenadante (S1) gentilmente separado do precipitado, obtendo-se um volume de cerca de 500 mL. O sobrenadante S1 foi então dividido em três alíquotas. Na primeira fração, 250 mL do S1 foram adicionados de 5 mL de uma solução-tampão de fosfato de sódio 1,0 mol⋅L-1 e pH 7,2 (para que a concentração final de fosfato fosse de aproximadamente 0,02 mol⋅L-1 ), sendo o pH da mistura ajustado para 7,2 utilizando-se uma solução de NaOH 2,0 mol⋅L-1 . Na segunda fração, outros 94 mL do sobrenadante S1 foram tamponados para um volume final de 250 mL, de modo que a solução final contivesse uma concentração de fosfato igual a 0,02 mol⋅L-1 e pH 7,2. E por fim, na terceira fração, 40 mL do S1 foram tamponados (0,02 mol⋅L-1 de íons fosfato e pH 7,2) para um volume final de 250 mL. Essas três novas soluções foram novamente centrifugadas sob refrigeração (4 °C) à rotação de 12000 × g durante 15 min, sendo os novos sobrenadantes cuidadosamente separados do precipitado utilizando-se uma pipeta graduada. O sobrenadante da solução obtida da primeira fração foi identificado como ‘Alimentação Livre de Ovomucina na diluição 1:2’ (ALO1:2), o da segunda fração como ‘Alimentação Livre de Ovomucina na diluição 1:7’ (ALO1:7) e o da terceira fração como ‘Alimentação Livre de Ovomucina na diluição 1:18’ (ALO1:18). As soluções foram mantidas sob refrigeração até seu uso.

2.3. Purificação da lisozima a partir das soluções de alimentação

Para a extração da lisozima das soluções livres de ovomucina, foram realizados experimentos em duplicata para cada solução de alimentação, utilizandose o aparato descrito a seguir. A coluna contendo o leito monolítico foi adaptada a um sistema contendo uma bomba peristáltica (Masterflex Easy Load II, com cabeçote 77201-60 e mangueira de norprene 6402-14, Cole-Parmer Instrument Co., Vernon Hills, EUA), uma válvula manual de quatro vias (SRV-4, código 19-2099- 01, GE Healthcare) e volume vazio de 1,88 mL (sem a coluna). O monitoramento contínuo da fase móvel foi feito utilizando-se um monitor UV-Vis920 (GE Healthcare) com filtro de UV de 280 nm, conectado a um sistema de aquisição de dados Spider8 (HBM, Darmstadt, Alemanha) controlado via computador por meio do software Catman v.4.5 (HBM). Todos os experimentos foram conduzidos à vazão constante de 1,0 mL⋅min-1 em ambiente climatizado a (20 ± 1) °C. A coluna utilizada foi lavada com 200 mL de água deionizada, 100 mL de uma solução de HCl 0,1 mol⋅L-1 e então equilibrada com 100 mL de solução-tampão de fosfato de sódio 0,02 mol⋅L-1 e pH 7,2. Em seguida, ela foi percolada por 60 mL da solução de alimentação