TESTE COM Saccharomyces Cerevisiae

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O procedimento do repique das células (Teste do Disco Central) em suspensão das linhagens na placa de Petri (Figura 1.) envolve a utilização de uma alça estéril para coleta de uma quantidade relativamente pequena do material biológico (levedura). Após a coleta, o material é inoculado de forma homogênea no decorrer das linhas desenhadas na placa (Figura 2).

Dessa forma, inocula-se cada uma das seis linhagens. Em sequência, é colocado no centro da placa um disco de papel filtro estéril e 10 µl das concentrações substância a ser testada (produto teste) que é, no caso, o isolado do gengibre.

Assim, logo após o procedimento, encubam-se as amostras por durante 48 horas na estufa à temperatura de 37ºC. Usa-se um controle negativo com salina e controle positivo com peróxido de hidrogênio.

Outro método é utilizar a substância diretamente com o peróxido de hidrogênio (no caso de substâncias oxidantes), se oxidante, pode usar diretamente peróxido ou pode ser usada em três tipos: co-tratamento, pré-tratamento ou pós-tratamento com peróxido de hidrogênio.

- Na utilização do co-tratamento: no mesmo momento em que se inocula a substância, se coloca peróxido de hidrogênio;

- Na utilização do pré-tratamento: cerca de das horas antes se inocula o peróxido e depois a substância;

- E no pós-tratamento: inocula-se primeiramente a substância teste e cerca de duas horas depois o peróxido de hidrogênio.

[pic 2] [pic 3]

Figura 1. Procedimento inoculação de linhagens no Teste do Disco Central. Figura 2. Placa de Petri com seis linhagens inoculadas.

- RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após o processo de repique e do encubação em estufa, pôde-se o observar crescimento da população de S. cerevisiae semeadas nas placas. Sabendo que no repertório de linhagens existia uma mutada com superóxido dismutase citoplasmática; uma mitocondrial; uma deficiente em catalase; uma deficiente superóxido dismutase citoplasmática e catalase e outra apresentando superóxido dismutase citoplasmática e mitocondrial. Pôde-se observar na prática cada uma das características das seis linhagens apresentam que as diferem na capacidade oxidativa. (Tabela 1.).

Tabela 1. Descrição das linhagens de S. cerevisiae usadas no estudo.

Descrição

Genótipo

Origem

EG103 (SODWT)

MATa leu2-3,112 up1-289 ura3-S2 GAL-

Edith Gralla. L. Angeles

EG118 (Sod 1N)

sod1::URA3 all other markers as EG103

Edith Gralla. L. Angeles

EG110 (Sod 2N)

sod2::TRP1 all other markers as EG103

Edith Gralla. L. Angeles

EG133 (Sod 1NSod2N)

sod1::URA3 sod2::TRP1 double mutant all other markers as EG103

Edith Gralla. L. Angeles

EG223 (Cat1N)

EG103, except cat1:: TRP!

Edith Gralla. L. Angeles

EG (Sod1NCat1N)

EG103, except sod1:: URA3 and cat 1:: TRP1

Edith Gralla. L. Angeles

Adaptado de Oliveira et al., 2014.

O resultado da encubação é observado com controle negativo (com solução salina) e controle positivo (com peróxido de hidrogênio) onde inibição bem maior do halo de crescimento. Dessa forma, observa-se se o extrato vai oxidar de forma semelhante ao peróxido de hidrogênio, pois este é composto é altamente oxidante a este nível celular. Assim, se analisa onde existe a inibição do crescimento da levedura e onde se tem halo de crescimento. Quando há inibição do crescimento significa então que esta apresenta propriedade oxidativa e quando há formação de halo de crescimento é porque esta não oxidou.

Desse modo, pode-se ver o nível de alteração genético das leveduras a partir da medição do diâmetro halo (mm), apagar nome dos discos com algodão, deixando apenas a numeração. Após a obtenção dos dados, analisam-se os resultados incluindo os dados em (mm) em programas estatísticos (como Prisma, PSS) para observar se houve significância com resultados esperados.

Baseado nisto, várias razões tornam a levedura S. cerevisiae um dos melhores modelos de sistema eucariótico unicelular para estudos de estresse oxidativo por tratar-se de um organismo provido de núcleo e de organelas com metabolismo semelhante à de eucariotos superiores. (HENRIQUES et al., 2001).

A facilidade e a rapidez na obtenção de gerações permite sua manipulação em laboratório para a realização dos mais diversos experimentos, com número grande de repetições e desenhos experimentais, além do custo acessível.

- CONCLUSÃO

Com base no conhecimento dos métodos e finalidade dos testes com Saccharomyces cerevisiae conclui-se que a levedura é um dos melhores modelos de sistema eucariótico unicelular para estudos de mecanismo de ação de diferentes antioxidantes, principalmente pelo fato do genoma de apresentar um genoma totalmente conhecido (ajudando na sua rápida e precisa identificação e caracterização) e dos ensaios que podem ser realizados facilmente, com custo acessível.

- REFERÊNCIAS

HENRIQUES, J. A. P.; DAFREÉ, A. L.; PICADA, J. N.; Maris, A. F.; SALVADOR, M. (2001). Espécies Reativas de Oxigênio e Avaliação de Antioxidantes em Sistemas Biológicos. In: Biotecnologia na Agricultura e na Agropecuária; Luciana Serafini, Neiva Barros e João Lúcio Azevedo