Imunoparâmetros Carcinicultura

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CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DA HEMOLINFA TOTAL (CP)

- Diluir inicialmente a amostra, em um eppendorf, ou seja, a hemolinfa total (3x diluída em anticoagulante) deve ser diluída agora em água destilada para 30x, em seguida para 300x a partir desta solução, em seguida para 900x e 3000x a partir da solução de 300x. (ver como fazer a diluição no esquema do experimento)

- Adicionar 20µL da amostra diluída 3000x de cada pool, em triplicata, em poços de uma microplaca de 96 poços (fundo chato); no experimento controle (branco) a amostra de hemolinfa é substituída por água destilada (fazer 3 poços apenas).

- Em seguida adicionar 200µL de solução de Bradford em cada poço. Homogeneizar com a pipeta individualmente para cada diferente amostra.

- Se a leitura for feita em cubetas, colocar 100 µl de amostra + 1000 µl de solução de Bradford em um eppendorf, incubar (como abaixo) e retirar uns 300 µl para colocar na cubeta e ler.

- Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente;

- Ler a placa em leitora de microplacas a 595 nm.

DILUIÇÃO DO SORO PARA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA

- Soro coletado sem anticoagulante

1ª Diluição

10x

50 µl do soro puro[pic 7]

+

450 µl de água destilada

2ª Diluição

100x

50 µl de soro

+[pic 8]

450 µl de água destilada

3ª Diluição

1000x

50 µl de hemolinfa (100x)

+[pic 9]

450 µl de água destilada[pic 10]

4ª Diluição

3000x

100 µl de hemolinfa (1000x)

+

200 µl de água destilada

5ª Diluição

6000x

100 µl de soro (1000x)

+

500 µl de água destilada

CÁLCULO DA CP DO PLASMA, SORO, HEMOLINFA TOTAL

- Deve-se antes diminuir a média da Abs. obtida da amostra pela média da Abs. do branco (para retirar a cor do Bradford). Este valor será o “y” que irá na fórmula do Excel, correspondente à Curva Padrão de BSA, anteriormente feita.

Ex.: y= 0,056 (média Abs. da amostra (triplicata) hipotética descontada do branco)

y = 0,0579 x – 0,05 (fórmula da curva padrão)

0,056 + 0,05 / 0,0579 = x

X= 1,84 ug em 100 µl x 10 (para dar o valor em µg/mL) = 18,4 µg/mL x 3000 (diluição) = 55.200 / 1000 (para transformar µg em mg) = 55,2mg/mL é a concentração proteica desta nossa amostra hipotética

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ATIVIDADE DA α2-MACROGLOBULINA

- Preparar as soluções abaixo IMEDIATAMENTE ANTES de iniciar experimento, a partir das soluções-estoque congeladas:

a) Em um eppendorf novo, diluir 25x a solução-estoque de tripsina (2,5mg/ml) em TA a temperatura ambiente (retire 1h antes da geladeira). Para isso, adicionar 40µl de solução estoque em 960µl de TA, a fim de obter tripsina a 100µg/ml (ou seja, em 50µl terá 5µg de tripsina).

b) Em outro eppendorf novo, diluir 10x a solução-estoque de IT (10 mg/ml) em TA a temperatura ambiente. Para isso, adicionar 100µl de solução mãe em 900µl de TA, a fim de obter inibidor de tripsina a 1mg/ml (ou seja, em 50µl terá 50µg de IT ou seja 10x mais concentrado que a tripsina).

c) Em um tubo Corning novo, aquecer 10 ml de TA a 30°C em banho-maria antes de começar o experimento. Após o aquecimento, pegar um eppendorf novo e diluir o BApNA (33,2 mM) 10x neste TA pré-aquecido (100µl de solução estoque em 900µl).

Obs.: BApNA é um peptídeo hidrofóbico e se colocar em TA não aquecido ou gelado, ele PRECIPITA e a reação não acontece. Cuidado!!

- Em uma microplaca (fundo chato), adicionar em três poços:

- 50µl da amostra (plasma/soro do camarão, soro humano ou TA) + 50µl da solução de tripsina (100µg/ml) e incubar por 15 min a 30°C (estufa). Tampar a placa para não evaporar.

- Fazer triplicata para cada amostra.

- O controle positivo é o plasma humano

- Controle da amostra (para subtrair a cor da hemocianina) é o soro + TA.

Obs.: 50 µl da solução contém 5 µg de tripsina na reação

- Em seguida, adicionar em cada poço 50µl de IT (1mg/mL) e incubar por 10 min a 30°C:

Obs.: 50 µl da solução contêm 50 µg de IT na reação, ou seja, estamos usando um excesso de inibidor de 10x

- Por fim, adicionar em cada poço 50µl de BApNA (solução 3,32mM) e IMEDIATAMENTE ler a absorbância a 405 nm nos tempos 0, 10, 20, 30 e 40 min, com leitora programada a 30°C.

Obs.: concentração final do BapNa na reação = 0,83 mM

CÁLCULO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DA Α2M (U/min/mg):

- Determinar previamente a concentração proteica da amostra

- Fazer a média das Abs. das triplicatas das amostras de soro e o controle da amostra (hemocianina) ÷ 0,001 = X ÷ tempo da reação (geralmente 10 min tem o maior Δ) = y ÷ concentração proteica do volume da amostra utilizado na reação (50 μl)

- A atividade especifica será dada em U/min/mg.

Obs.: