OS CULTIVOS EM ALTA DENSIDADE CELULAR

Produccion de proteina recombinante en E. coli

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA BIOQUÍMICO - FARMACÊUTICA

PROJETO DE MESTRADO

CULTIVO DE Escherichia coli EM ALTA DENSIDADE CELULAR PARA PRODUÇÃO DE L-ASPARAGINASE II EM BIORREATOR

Aluno: Juan Carlos Flores Santos

Orientador: Prof. Dr. Michele Vitolo (FCF/USP)

São Paulo – SP

Maio/2014

SUMARIO

RESUMO 3

INTRODUÇÃO 5

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6

1.1 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA 6

1.2 L-ASPARAGINASE 7

1.3 CULTIVOS EM ALTA DENSIDADE CELULAR 8

1.3.1 Fatores que influenciam o crescimento em cultivos em biorreator 8

1.3.1 Estratégias de alimentação 9

1.3.2 Fatores que influenciam a síntese de L-asparaginase II 10

1.4 EXPRESSÃO E EXPORTAÇÃO DE PROTEÍNAS EM E. coli 12

2. OBJETIVO GERAL 13

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 13

3. MATERIAL E MÉTODOS 14

3.1 MATERIAL 14

3.2 MÉTODOS 15

3.2.1 Manutenção e Reativação (Pré- inóculo) da E. coli 15

3.2.2 Preparo do inóculo de E. coli para estudos em agitador metabólico 15

3.2.3 Preparo da curva de massa seca em função de densidade ótica(D.O.) 15

3.2.4 Cultivos de E. coli em agitador metabólico 15

3.2.1 Estudos da E. coli em biorreator em processo descontinuo 16

3.2.2 Estudos da E. coli em biorreator em processo descontinuo-alimentado 17

3.2.3 Expressão da L-asparaginase II em biorreator (fase de indução) 18

3.3 DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS 18

3.3.1 Determinação da concentração celular 18

3.3.2 Fracionamento celular 19

3.3.3 Atividade enzimática 19

3.3.4 Quantificação de Proteínas Totais 20

3.3.5 Determinação de glucose 20

3.3.6 Determinação de glicerol 20

3.3.7 Determinação de acetato 21

3.4 CALCULOS DOS PARÁMETROS CINÉTICOS 21

3.4.1 Velocidades Específicas de Transformação (µ, µs e µp) 21

3.4.2 Fatores de Conversão (, , ) 22

3.4.3 Produtividade em Células e Produto (, ) 23

3.4.4 Tempo de Geração (tg) 23

4. Análise dos Resultados 23

5. Cronograma de Atividades 24

5.1 Cronograma experimental 24

5.2 Cronograma de disciplinas proposto 24

6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 25

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RESUMO

Utilizada amplamente como agente terapêutico para o tratamento de leucemia linfoblástica aguda (ALL) e linfomas não - Hodgkin, a L-Asparaginase II é uma enzima que atua diminuindo a concentração de asparagina livre no plasma. Dessa forma, impede o fornecimento de asparagina para a proliferação de células malignas, as quais ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar a asparagina. A L-Asparaginase utilizada atualmente no Brasil é importada, o que gera problemas com custo e abastecimento. Sendo assim , é notavelmente atrativa a procura por sistemas que apresentem níveis elevados de expressão de asparaginase e o encontro de formas de produzir tal enzima para um fácil acesso e, se possível, com menor potencial alérgico. Isso nos incentiva a estudar a produção biotecnológica de L-Asparaginase II produzida por Escherichia coli recombinante que super expressa a enzima. O objetivo de este projeto é estudar a produção de L-asparaginase II em processo descontinuo e descontinuo-alimentado utilizando como estratégia para o melhoramento da produtividade de L-asparaginase, o crescimento em alta densidade celular de E. coli e estudar a fase de indução da síntese desta enzima. Para isso, as variáveis a serem avaliadas durante a fase de crescimento de E. coli são: vazão de alimentação exponencial, concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultivo e fonte de carbono na solução de alimentação , controlando a velocidade especifica de crescimento celular, pH, temperatura, e acompanhando a concentração de acetato e do substrato. Durante a fase de indução da enzima serão avaliados os seguintes parámetros: concentração do indutor, concentração de oxigênio dissolvido e temperatura de indução.

Palavras chave: L-Asparaginase, E. coli, biorreator, alta densidade