Projeto e Artigo sobre genotipagem com RFLP

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Acompanharam a linha de raciocíonio?

Aí então vocês continuam com as partes do projeto, tudo certinho como fizeram no ano passado. Depois no início do 2ºBimestre faremos a parte técnica, mas como podem perceber, ele é apenas um modelo experimental de genotipagem, a informação em si será dos agentes infeciosos que escolherem (lembrando que no mínimo 3 e sim, um deles pode ser o T. cruzi), por isso, não há necessidade de esperar realizar a metodologia, já podem ir trabalhando no artigo assim que finalizar o projeto.

A parte dos resultados do artigo que vai precisar um pouco mais da técnica, mas é coisa simples, como falamos na introdução, é um modelo experimental simplesmente para demonstrar uma genotipagem, diferenciar esta de um diagnóstico qualitativo simples.

Quanto à metodologia, aqui vai as informações necessárias. Os métodos de PCR do 330pb e do RFLP de COII podem ser copiados e colados, entretanto a seção da metodologia deve ser escrita por cada um, pois, por mais que a informação seja a mesma, cada um tem um jeito diferente de apresentar.

MATERIAIS E MÉTODOS

Bom, vocês realização duas técnicas de PCR, uma de diagnóstico e a outra de genotipagem. Dois padrões genéticos de T. cruzi serão utilizados como controle da reação, sendo a cepa 150 que é o padrão (controle) de T. cruzi I (DTU TcI), e a cepa 1256 que é o padrão (controle) de T. cruzi II (DTU TcII). As amostras que serão utilizadas são DNAs isolados de 12 pacientes com doença de Chagas que estão estocadas no laboratório de Parasitologia da Universidade Estadual de Maringá. As informações sobre as amostras como local de isolamento, gênero do paciente, idade, aprovação do comitê de ética vamos deixar de fora, pois além do foco ser outro, não comporta essas informações para o momento.

Bom, quaisquer duvidas que tiverem sobre a metodologia podem me procurar, ou enviar email. Quanto ao trabalho, comecem a apresentar para eu e a prof. Bárbara, pois o prazo de entrega está logo aí e vocês podem e devem nos consultar para não entregar coisas erradas. Mas já aviso de antemão, não nos mostrar o trabalho um dia ou dois dias antes da entrega, pois não teremos tempo para ajudar, se for para nos mostrar, precisa ser com no mínimo 5 dias úteis de antecedência!

Amplificação do minicírculo 330pb (marcador de diagnóstico): A reação em cadeia da polimerase PCR será realizada pelo protocolo de Miyamoto et al. (2006 e 2008), utilizando os iniciadores 121 (5’AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA3’) e 122 (5’GGTTCGATTGGG GTTGGTGTAATATA3’) descritos por Wincker et al. (1994), que amplificam um fragmento de 330 pb. O material será submetido à amplificação com um ciclo inicial de 95ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos com desnaturação a 95ºC por 1 min, anelamento dos iniciadores a 65ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min. O DNA amplificado será visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida a 4,5% revelado pela prata. Amostras que apresentarem a banda de 330pb no gel serão consideradas PCR positivas para T. cruzi.

PCR/RFLP-COII

A amplificação da subunidade II da citocromo oxidase (COII) seguido da análise do fragmento de restrição (RFLP) pela enzima AluI foi realizado de acordo com Freitas et al., (2006) com modificações propostas por Abolis et al., (2011) e Sá et al.,(2013). De acordo com o último autor, o RFLP-COII permite detectar e separar simultaneamente os grupos de T. cruzi (DTU TcI-TcV=TcVI) de T. rangeli (KP1+ e KP1-). A reação foi conduzida em termociclador Techne TC-512 com volume final de 15 uL, contendo 3.1 pmol de cada iniciador Tcmit-10 (5′-CCATATATTGTTGCATTATT-3′) e Tcmit-21 (5′-TTGTAATAGGAGTCATGTTT-3′), 2ng de DNA, 2,5 μM de dNTP, 3,5 mM de MgCl2, e 1 U de Taq Polimerase Platinum (Invitrogen) no tampão fornecido pelo fabricante. A amplificação foi realizada com desnaturação inicial a 94°C por 1 min, seguido por 30 ciclos (94°C por 30 s, 48°C por 2 min, e 72°C por 2 min) e extensão final a 72°C por 10 min. Dez microlitros da reação foi digerida pela enzima de restrição AluI (New England BioLabs) em tampão NEB 4 fornecido pelo fabricante por 16 horas a 37ºC. Os fragmentos foram analisados em gel de poliacrilamida a 6% revelados pela por nitrato de prata e digitalmente fotografados.

Referências utilizadas na metodologia

Miyamoto, C. T.; Gomes, M. L.; Marangon, A. V.; Araújo, S. M.; Bahia, M. T.; Lana, M.; Toledo, M. J. O. Trypanosoma cruzi: Sensitivity of the polymerase chain reaction for detecting the parasite in the blood of mice infected with different clonal genotypes. Exp Parasitol, 2006; 112:198-201.

Miyamoto, C. T.; Gomes, M. L.; Marangon, A. V.; Araújo, S. M.; Bahia, M. T.; Martins-Filho, A. O.; Lana, M.; Toledo, M. J. O. Usefulness of the polymerase chain reaction for monitoring cure of mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal genotypes following treatment with benznidazol. Exp Parasitol, 2008; 120:45–49.

Wincker, P.; Britto, C.; Pereira, J. B.; Cardoso, M. A.; Oelemann, W.; Morel, C. M. Use of a simplified polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in blood samples patients in a rural endemic area. Am J Trop Med Hyg 1994; 71: 771-777.

Freitas,