A Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos

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Após a precipitação com etanol, identificou-se 7 tubos de ensaio, de acordo com a Tabela 1. A cada tubo, adicionou-se 125 µL de sacarose 0,1 M (substrato para a invertase) e 100 µL de tampão acetato 100 mM pH 5, homogeneizando-os e, posteriormente, incubando-os por 10 minutos a 30ºC. O volume de amostra adicionado em cada tubo está descrito na Tabela 1.

Tabela 1. Volume de suspensão de Saccharomyces cerevisiae/tampão acetato 100 mM pH 5 utilizado para dosagem de atividade enzimática após o rompimento celular em moinho de bolas e permeabilização celular, seguido de precipitação com solvente orgânico.

Amostra

Volume de amostra/tampão

Branco

25 µL de tampão

Extrato celular - permeabilização

25 µL de amostra

Extrato celular - moinho de bolas

25 µL de amostra

Sobrenadante 1*

19 µL de amostra / 6 µL de tampão

Pellet 1*

19 µL de amostra / 6 µL de tampão

Sobrenadante 2*

15 µL de amostra / 10 µL de tampão

Pellet 2*

15 µL de amostra / 10 µL de tampão

* referente ao rompimento celular através do moinho de bolas.

Incubou-se todos os tubos a 30ºC por 30 minutos, adicionando, em seguida, 250 µL do reagente DNS e incubando-os novamente a 100ºC por 5 minutos. Resfriou-os em um recipiente com água a temperatura ambiente e adicionou-se a cada um deles 2 mL de água destilada, agitando-os. Realizou-se a leitura da absorbância referente à cada amostra a 540 nm.

Resultados

Os valores de absorbância, a 540 nm, e os fatores de diluição obtidos para as amostras de Saccharomyces cerevisiae, a 0,35 g mL-1, após rompimento celular utilizando moinho de bolas e permeabilização celular e posterior precipitação com solvente orgânico estão descritos na Tabela 2.

Tabela 2. Valores de absorbância, a 540 nm, referentes às amostras de Saccharomyces cerevisiae após rompimento celular com moinho de bolas e permeabilização celular e precipitação por solvente orgânico. O branco está descontado das demais absorbâncias.

Amostra

Absorbância 540 nm

Fator de diluição

Branco

0,066

-

Extrato celular - permeabilização

0,014

1

Extrato celular - moinho de bolas

0,174

1

Sobrenadante 1*

1,146

1,29

Pellet 1*

0,714

4

Sobrenadante 2*

0,940

1,29

Pellet 2*

2,484

3

* referente ao rompimento celular através do moinho de bolas.

A fim de calcular a atividade enzimática da invertase, utiliza-se a Equação I, fornecida por MOURA et al. (2007), descrita a seguir.

Equação I[pic 1]

onde:

Absamostra: absorbância da amostra;

Absbranco: absorbância do branco correspondente;

Fator: fator de concentração da curva-padrão de glicose (mg/L);

Diluição: diluição do extrato enzimático;

540: fator de conversão para atividade (u.m.a-1 x min-1).

O fator de concentração da curva-padrão de glicose requerido na Equação I é obtido pelo inverso do coeficiente angular da curva-padrão de glicose (MOURA et al., 2007), fornecido pela docente. Uma vez que a equação da reta referente à curva padrão de glicose é dada por f(x)=1,27x-0,06, com coeficiente de determinação (R²=1), seu coeficiente angular é 1,27. Desta forma, o fator de concentração da curva padrão de glicose possui valor numérico de 0,7874.

A partir do valor do fator de concentração da curva-padrão e dos dados dispostos na Tabela 2, é possível calcular a atividade enzimática da invertase em cada amostra. Os valores de atividade da invertase, referentes a cada amostra, estão descritos na Tabela 3.

Tabela 3. Valores da atividade enzimática da invertase (U) presente em diferentes amostras e o respectivo fator de purificação, provenientes de Saccharomyces cerevisiae, após rompimento celular através de moinho de bolas e permeabilização celular, seguido de precipitação por etanol.

Amostra

Volume de amostra (mL)

Atividade enzimática da Invertase (U)

Fator de purificação

Branco

2,5

-

-

Extrato celular - permeabilização

2,5

2,041 x 10-5

1

Extrato celular - moinho de bolas

2,5

2,537 x 10-4