Técnicas Histologicas

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El formaldehído comercial se obtiene en soluciones al 40% P/V en agua (formol) y se lo diluye

10 veces para obtener la formalina, cuya concentración final de formaldehído es del 4% P/V. Como ya se ha mencionado anteriormente, los tejidos se sumergen en esta solución o se perfunden con la misma.

Con la finalidad de mantener el pH y la osmolaridad, las diluciones se realizan con una solución buffer o amortiguadora de fosfato 0,1 M pH 7,4. En ambos casos, el empleo de mezclas frías (4 °C) retarda los procesos de autólisis y favorece la acción del fijador.

Otros fijadores simples son: el alcohol metílico, que se emplea para los frotis celulares; el bicloruro de mercurio, que es una sustancia oxidante ácida que permite buenas coloraciones nucleares; el tetróxido de osmio al 1-2% P/V, que es ácido, volátil y tiene gran afinidad por los lípidos; el bicromato de potasio, y el ácido acético. El alcohol etílico se puede emplear como fijador pero tiene el inconveniente de endurecer mucho las piezas.

Mezclas fijadoras. La más empleada en la microscopia óptica es la mezcla de Bouin, que contiene ácido pícrico, formol y ácido acético. La presencia de ácido acético en esta mezcla favorece la penetración del fijador en la muestra. Otras mezclas son el líquido de Zenker (bicromato, acético) y el líquido de Helly (bicromato, formol).

2.2Fijadores físicos

El frío permite conservar las muestras biológicas. En histología se emplea la congelación, la cual se puede realizar en nitrógeno líquido o por medio de mezclas refrigerantes con hielo seco y acetona. Los bloques de tejido se mantienen en congeladores (freezers) y se cortan en secciones utilizando un equipo denominado crióstato. La congelación no desnaturaliza las proteínas, y muchas de sus propiedades reaparecen al hidratarse el tejido; a consecuencia de ello se reproducen procesos de autólisis, razón por la cual se dice que el frío no es un fijador estrictamente hablando.

Las secciones suelen posfijarse mediante inmersión en formalina. Sin embargo, la congelación permite mantener en el tejido componentes químicos que son extraídos por los solventes durante el procesamiento de la técnica histológica de rutina o convencional (fijación por inmersión en fijadores químicos y coloración con hematoxilina-eosina). Además, la congelación evita las alteraciones antigénicas que ocurren por efecto de los fijadores químicos y los solventes orgánicos. Por lo mencionado, el empleo de congelación y la realización de secciones con el crióstato se han popularizado en inmunocitoquímica.

Finalmente, la congelación ofrece la ventaja de preservar la actividad de las enzimas en los tejidos para su demostración por medio de técnicas enzimáticas.

La congelación se emplea ampliamente en el diagnóstico anatomopatológico durante intervenciones quirúrgicas. Es habitual que en los grandes quirófanos haya un crióstato o un micrótomo de congelación. Si bien la congelación-desecación no es un procedimiento rutinario, es el procedimiento de elección para llevar a cabo estudios histoquímicos.

Para los estudios de frotis de sangre o suspensiones celulares de líquidos de punción abdominal o torácica, es común desecar la muestra sobre el portaobjeto y flamearlo 3 a 4 veces sobre la llama de un mechero; de este modo se coagulan las proteínas y luego se procede a la coloración de la muestra.

También se pueden desecar a temperatura ambiente y fijar las muestras por inmersión en alcohol metílico.

3. Deshidratación

La inclusión tiene por objetivo endurecer homogéneamente el tejido para lograr obtener secciones delgadas que puedan observarse al microscopio óptico. Con esta finalidad, el tejido es embebido en parafina o en un medio sintético similar (Paraplast®). Estos medios son hidrofóbicos; por tanto, antes de la inclusión en parafina, la muestra debe ser deshidratada. La deshidratación se logra mediante pasajes en alcoholes de gradación creciente (alcohol 50°, 70°, 96° y 100°). Luego el tejido se sumerge en un solvente orgánico, generalmente xileno o tolueno, que desplaza al alcohol y que es solvente de la parafina. Durante este paso, el tejido se vuelve translúcido, razón por la que esta fase se conoce como aclaración. Si la muestra se ve de «aspecto lechoso», la deshidratación ha sido insuficiente y hay que recomenzar el proceso.

4. Inclusión

Durante este paso, el bloque se embebe en parafina o medios sintéticos análogos como el paraplast. A temperatura ambiente, la parafina (o el paraplast) tiene la consistencia de una vela. Es necesario calentarla para que pase al estado líquido. Para ello, los bloques de parafina se ponen en un vaso de precipitado en una estufa a 60 °C. Una vez que el tejido ha sido aclarado, se sumerge la muestra en un recipiente que contiene parafina líquida/xilol (mezcla 1:1) y se lo deja en el interior de la estufa de inclusión. A continuación, se hacen otros dos pasajes de 2 h cada uno en parafina líquida pura durante los cuales la parafina desplaza al xilol. Se construye un molde en papel, en aluminio o en barras de metal («barras de Leuckart»), en el que se coloca el bloque de tejido embebido en parafina y se llena con parafina líquida orientando el bloque de tejido según el sentido en el que luego se quieran hacer los cortes. Después se enfría el molde, de modo que la parafina se solidifica y se obtiene el taco.

5 Corte

Los tacos de parafina que contienen la muestra se cortan con un instrumento denominado micrótomo.

El micrótomo se asemeja a una máquina de cortar fiambre; posee una manivela que se gira manualmente (también los hay automáticos) y que hace que la pieza, donde se fija el taco, avance automáticamente apenas unos pocos micrones y descienda sobre el filo de la cuchilla para realizar la sección. Generalmente, las secciones para microscopio óptico tienen un espesor de 5 mm. Las secciones se levantan con un pincel y se sumergen en un baño termostático con agua a 40 °C. Esto hace que las secciones se estiren.

Luego se sumerge un portaobjeto gelatinado o pretratado con albúmina en el baño y, con ayuda de un pincel, se ubica la sección sobre la superficie del portaobjeto mientras se eleva éste. Los portaobjetos con las secciones se dejan secar a temperatura ambiente o sobre una platina a 40 °C para que las secciones se adhieran a la superficie del vidrio. La finalidad del pretratamiento