Bioinformática (BQI 460)

...

Diagonal -> 0 -1 = -1

Superior -> -3 -3 = -6

Lateral -> -3 -3 = -6

- T com T (segunda linha e terceira coluna de números):

Diagonal -> -3 +1 = -2

Superior -> -6 -3 = -9

Lateral -> -1 -3 = -4

- G com T (segunda linha e quarta coluna de números):

Diagonal -> -6 -1 = -7

Superior -> -9 -3 = -12

Lateral -> -2 -3 = -5

→ Alinhamentos possíveis após a realização dos cálculos e montagem da tabela:

ATGGCAAG ATGGCAAG ATGGCAAG

- T - GAACG - TGA - ACG -TG – AACG

Bit Score: -4 Bit Score: -4 Bit Score: -4

(-3+1-3+1-1+1-1+1) (-3+1+1-1-3+1-1+1) (-3+1+1-3-1+1-1+1)

→ Análise dos resultados: Como todos os Bit Scores possuem o mesmo valor, os três alinhamentos são igualmente bons.

2) Conforme a lista de proteínas em anexo indicada para cada aluno, recupere a sequência proteica ortóloga para Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Mus musculus e Homo sapiens, depositadas no NCBI.

→ Proteína indicada: β-ketothiolase (acetyl-CoA acyltransferase/ 3-ketoacyl-CoA thiolase)

→ Ordem dos “print´s”: igual à solicitada pelo exercício

→ Observação: sequências coladas no Bloco de Notas estão em anexo no email

[pic 85]

[pic 86]

[pic 87]

[pic 88]

3) Alinhe globalmente as quatro sequências utilizando o programa CLUSTAL OMEGA web server. Qual a identidade entre as sequências?

[pic 89]

[pic 90]

[pic 91]

Pela análise dos dados fornecidos pelo CLUSTAL (alinhamento e matriz de identidade), é possível perceber que a sequência de aminoácidos da β-ketothiolase apresenta maior identidade entre os organismos M.musculus e H.sapiens (87,91% de identidade), ou seja, a sequência dessa enzima é mais parecida entre esses dois organismos que quando comparada aos outros dois (S. cerevisiae e E. coli).

A sequência da enzima em E. coli é mais parecida com H.sapiens (58,10% de identidade); em S. cerevisiae, é mais parecida com E. coli (50,49% de identidade); em M. musculus, é mais parecida com H. sapiens (87,91% identidade).

4) Utilizando o BLAST implementado no site do NCBI, encontre a proteína ortóloga de Caenorhabditis elegans. Qual o e-value do melhor alinhamento? O que se pode concluir sobre a qualidade deste alinhamento?

→ Sequência FASTA (Fonte: NCBI):

[pic 92]

[pic 93]

[pic 94]

O e-value nos faz ter uma ideia de quão significativos são os alinhamentos obtidos. Seu valor diminui com o aumento do score. Ou seja, quanto menor o valor de e-value, maior o score e melhor o alinhamento. Dessa forma, como a primeira sequência apresentou o menor e, portanto, melhor, valor de e-value (2e-165), é ela que pode ser definida como a sequência ortóloga de C. elegans.

Porém, esse alinhamento possui baixa porcentagem de identidade, indicando que as sequências alinhadas não possuem tantos aminoácidos na mesma posição.

5) Construa a árvore filogenética para as cinco proteínas acima (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Mus musculus, Homo sapiens e C. elegans) utilizando a técnica de máxima verossimilhança com valor de bootstrap de 1000 reamostragens. O que se pode concluir sobre a qualidade da árvore gerada? O que se pode concluir sobre a evolução desta proteína?

[pic 95]

[pic 96]

O valor de Bootstrap equivale ao número de vezes que o agrupamento ocorreu. Quanto maior esse valor, melhor, pois significa que o ramo possui melhor qualidade.

O valor de Bootstrap igual a 100 indica que em 100% das amostragens, as sequências proteicas de β-ketothiolase em M. musculus e H. sapiens estavam reunidas em um ramo contendo apenas as duas sequências. Ou seja, a árvore é altamente confiável e essas duas espécies possuem alta semelhança entre si.

O valor de Bootstrap igual a 59 indica que em 59% das amostragens, as sequências proteicas de β-ketothiolase em M. musculus, H. sapiens e S. cerevisiae estavam reunidas em um ramo contendo apenas as três sequências.