A Cinética Enzimática
Por: Lidieisa • 13/3/2018 • 1.820 Palavras (8 Páginas) • 276 Visualizações
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Iniciou-se a contagem do tempo e retiraram-se alíquotas de 200μL da solução para que fossem colocadas nos poços da placa de elisa, nos tempos estipulados na tabela a seguir.
TUBO
NaOH 2M
(μL)
Tempo de Incubação (min)
Alíquota do meio de reação (μL)
B
6,25μL
0
200μL
1
6,25μL
3
200μL
2
6,25μL
6
200μL
3
6,25μL
9
200μL
4
6,25μL
12
200μL
5
6,25μL
15
200μL
6
6,25μL
20
200μL
7
6,25μL
30
200μL
8
6,25μL
45
200μL
Tabela 1
Após a coleta do último ponto de 45 minutos, foi feita a leitura de absorbância, a 405 nm, no leitor de elisa, utilizando-se o primeiro poço como branco, para calibração do aparelho.
- Construção da curva padrão de PNP:
Transferiu-se alíquotas das soluções indicadas na tabela abaixo, com auxílio de pipetas automáticas.
Tubos
Sol. Padrão de PNP (μL)
Tampão Tris-HCl,pH 9,5 (μL)
Solução de NaOH 2M (μL)
B
0
800
200
1
75
725
200
2
150
650
200
3
225
575
200
4
300
500
200
5
375
425
200
6
450
350
200
7
525
275
200
Tabela 2
Homegenizou-se os tubos de ensaio manualmente e transferiu-se 200μL de cada tubo para uma placa de 96 poço para leitura em 405 nm no leitor de elisa.
- Influência da temperatura:
Transferiu-se, com auxílio da pipeta automática, alíquotas de 500 μL da solução de tampão Tris-HCl e 250 μL da solução de PNPP para tubos de ensaio rotulados de 1 a 4 e de B1 (primeiro tubo branco) a B4. Os tubos foram colocados em incubação durante 5 minutos em diferentes temperaturas para cada tubo:
1 e B1 – 4°C
2 e B2 – temperatura ambiente
3 e B3 – 37°C
4 e B4 – 68°C
Após a incubação, utilizando-se a pipeta automática adicionou-se 50 μL de enzima a cada um dos tubos de 1 a 4, em intervalos de 10 segundos. Foi feita a homogeneização dos tubos manualmente. Em seguida e colocou-se novamente os tubos em suas respectivas temperaturas e incubou-se por 20 minutos.
Após 20 minutos adicionou-se uma alíquota de 200 μL de NaOH 2M a cada um dos tubos utilizando-se a pipeta automática, em intervalos de 5 em 5 segundos.Homogeneizou-se os tubos manualmente. Transferiu-se 200 μL da solução contida em cada tubo de ensaio para a placa de elisa, para posterior leitura em 405 nm, no leitor de elisa.
- Influência do pH
Transferiu-se, com o auxílio de pipeta automática, alíquotas das soluções indicadas para os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto as soluções de enzima e de NaOH.
Tubo no
Solução tampão Citratato-HCl (μL)
Solução tampão
Tris-HCl (μL)
Solução tampão
Borato-NaOH (μL)
PNPP 10mM (μL)
Enzima
(μL)
pH 5,5
pH
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