A Cinética Enzimática

...

Iniciou-se a contagem do tempo e retiraram-se alíquotas de 200μL da solução para que fossem colocadas nos poços da placa de elisa, nos tempos estipulados na tabela a seguir.

TUBO

NaOH 2M

(μL)

Tempo de Incubação (min)

Alíquota do meio de reação (μL)

B

6,25μL

0

200μL

1

6,25μL

3

200μL

2

6,25μL

6

200μL

3

6,25μL

9

200μL

4

6,25μL

12

200μL

5

6,25μL

15

200μL

6

6,25μL

20

200μL

7

6,25μL

30

200μL

8

6,25μL

45

200μL

Tabela 1

Após a coleta do último ponto de 45 minutos, foi feita a leitura de absorbância, a 405 nm, no leitor de elisa, utilizando-se o primeiro poço como branco, para calibração do aparelho.

- Construção da curva padrão de PNP:

Transferiu-se alíquotas das soluções indicadas na tabela abaixo, com auxílio de pipetas automáticas.

Tubos

Sol. Padrão de PNP (μL)

Tampão Tris-HCl,pH 9,5 (μL)

Solução de NaOH 2M (μL)

B

0

800

200

1

75

725

200

2

150

650

200

3

225

575

200

4

300

500

200

5

375

425

200

6

450

350

200

7

525

275

200

Tabela 2

Homegenizou-se os tubos de ensaio manualmente e transferiu-se 200μL de cada tubo para uma placa de 96 poço para leitura em 405 nm no leitor de elisa.

- Influência da temperatura:

Transferiu-se, com auxílio da pipeta automática, alíquotas de 500 μL da solução de tampão Tris-HCl e 250 μL da solução de PNPP para tubos de ensaio rotulados de 1 a 4 e de B1 (primeiro tubo branco) a B4. Os tubos foram colocados em incubação durante 5 minutos em diferentes temperaturas para cada tubo:

1 e B1 – 4°C

2 e B2 – temperatura ambiente

3 e B3 – 37°C

4 e B4 – 68°C

Após a incubação, utilizando-se a pipeta automática adicionou-se 50 μL de enzima a cada um dos tubos de 1 a 4, em intervalos de 10 segundos. Foi feita a homogeneização dos tubos manualmente. Em seguida e colocou-se novamente os tubos em suas respectivas temperaturas e incubou-se por 20 minutos.

Após 20 minutos adicionou-se uma alíquota de 200 μL de NaOH 2M a cada um dos tubos utilizando-se a pipeta automática, em intervalos de 5 em 5 segundos.Homogeneizou-se os tubos manualmente. Transferiu-se 200 μL da solução contida em cada tubo de ensaio para a placa de elisa, para posterior leitura em 405 nm, no leitor de elisa.

- Influência do pH

Transferiu-se, com o auxílio de pipeta automática, alíquotas das soluções indicadas para os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto as soluções de enzima e de NaOH.

Tubo no

Solução tampão Citratato-HCl (μL)

Solução tampão

Tris-HCl (μL)

Solução tampão

Borato-NaOH (μL)

PNPP 10mM (μL)

Enzima

(μL)

pH 5,5

pH