Como Trabalhar com o Microscópio

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A microscopia de campo claro possui o tipo de iluminação produzido pelos microscópios ópticos comuns, o microscópio óptico composto (MO). Neste tipo de microscópio, a luz segue uma trajetória que se inicia na fonte luminosa e termina no olho do observador. Mas até chegar aos olhos, após sair de sua fonte luminosa, esta, passa por diversos elementos ópticos. Raios de luz partem do iluminador, passando então pelas lentes do condensador que direcionam os raios de luz pela amostra analisada. Posteriormente passam pelas lentes objetivas, que são as lentes mais próximas da amostra, e direcionadas a um prisma onde a trajetória sofrerá varias mudanças de direção, até finalmente chegarem as lentes oculares onde novamente a imagem sofre ampliação.

A resolução de um microscópio pode ser definida como a capacidade que suas lentes possuem em diferenciar estruturas e os detalhes da mesma. Deste modo, o limite de resolução é a capacidade máxima do microscópio em separar detalhes, e refere-se então, mínima distancia necessária entre dois pontos, de modo que estes apareçam individualizados. O fator determinante da riqueza dos detalhes da amostra analisada por um microscópio é o seu limite de resolução, que depende essencialmente das lentes objetivas e do comprimento de luz utilizado.

Em um microscópio, existem dois sistemas de focalização da amostra, a focalização comum e a focalização fina. O primeiro sistema consiste de um mecanismo de direção que move o plano de amostra. No primeiro passo para a obtenção da imagem da amostra utiliza-se este tipo de focalização. A partir daí, utiliza-se a focalização fina onde os movimentos são precisamente controlados para se obter uma profundidade de foco usando as lentes objetivas.

O sistema de iluminação de um microscópio pode estar situado abaixo ou acima do plano de amostra. Os microscópios invertidos são os que possuem a iluminação no plano superior da amostra e é muito utilizado em análise de amostras opacas. No modo de iluminação de campo claro e invertido, a luz viaja ao longo do eixo óptico, através da objetiva em direção à amostra que está sendo observada e a amostra é visualizada pela luz que ela reflete.

Os conjuntos de lentes que operam num microscópio de luz são primeiramente as objetivas, um conjunto de pequenas e esféricas lentes, que variam normalmente a ampliação de 5 a 100 vezes, este conjunto é responsável pela focalização a uma curta distância do tubo microscópico, as imagens geradas são então ampliadas por uma segunda lente, que traz para o campo de visualização, estas lentes são denominadas oculares e encontra-se na região mais próxima ao observador.

Os microscópicos são compostos de vários componentes que realizam funções individuais, a fim que o coletivo gere a ampliação do objeto observado, pode ser citado, por exemplo, as lentes oculares e objetivas (discutidas anteriormente), pinça, platina, diafragma, fonte de iluminação, condensador, revolver e os parafusos macrométricos e micrométricos.

As funções destes componentes como já citadas, são singulares, como as lentes responsáveis pela ampliação e focalização, a fonte luminosa responsável por iluminar o corpo a ser analisado, os parafusos macrométricos e micrométricos responsáveis por comandar o foco gerado pelas oculares, pinça que fixa a lamina a ser observada na platina, que por sua vez, além de abrigar a lamina, está também é responsável por se deslocar tanto longitudinalmente quanto latitudinalmente, além de permitir que a luz da fonte luminosa transpasse a amostra (através de uma abertura em sua superfície).

O condensador que é um conjunto de no mínimo duas lentes convergentes com a função de orientar e distribuir a luz oriunda da fonte luminosa de forma uniforme pelo campo de visão do microscópico. Por fim, o diafragma é um componente que merece atenção, por não trabalhar diretamente com a amostra a ser analisada (o mesmo se aplica ao condensador), sua função está diretamente associada à estrutura da fonte luminosa e seu correto funcionamento, uma vez que o diafragma é um conjunto de palhetas que podem ser aproximadas ou afastadas do centro, através do controle de uma alavanca ou parafuso, possibilitando a regulagem da intensidade luminosa que incide sobre o corpo, e consecutivamente no campo de visão do observador. Esses dois componentes são apresentados na Figura 1.

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FIGURA 1 – Condensador e Diafragma, fonte: http://www.ciencias.seed.pr.gov.br/modules/galeria/detalhe.php?foto=1921&evento=7

O princípio do microscópico de luz, ou microscopia óptica, está ligado com a incidência de luz sobre o corpo a ser analisado, sobre um conjunto de lentes de ampliação, esse conjunto de lentes é responsável então por diferenciar dois, ou mais, distinto pontos da amostra, através de dois fundamentos, o primeiro, baseado na singularidade do comprimento de onda irradiado, e pela abertura do conjunto de lentes, esses dois fundamentos são o que definem o poder de resolução.

Assim sendo, o poder de resolução é definido como a capacidade de distinguir dois distintos pontos, entretanto, na prática, o poder de resolução é definido como a menor distância existente entre dois pontos que se apresentam individualizado, logo, quanto menor for o foco limite da lente objetiva, maior será o poder de resolução que está irá possuir, o limite máximo de resolução da lente objetiva empregada em um microscópico óptico é denominado, LR e é dado pela Equação 1.

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Onde, ⅄ é o comprimento de onda da radiação utilizada, a.n, equivale a abertura numérica da objetiva, definida como, à medida da capacidade de uma lente para receber luz, é dada pela Equação 2, por sua vez, K é uma constante positiva de valor a 0,61.

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Onde n é o índice de refração da luz do meio entre o objeto e a objetiva, comumente, n assume valor de 1 para o ar, 1,33 para água e 1,5 para o vidro e óleo de imersão. Já θ é o semiângulo de abertura, dado pelo eixe óptico e os raios externos do feixe de luz que penetram na objetiva.

Os microscópicos ópticos são também denominados microscópicos ópticos compostos, ou simplesmente, M.O.C. Estes são assim denominados por serconstituída por duas partes, a primeira é denominada mecânica e a segunda, óptica, sendo que cada uma dessas duas partes engloba uma série de componentes. A Figura 2 apresenta o esquema de um M.O.C.

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