REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

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3. Influência do pH na termocoagulação

A maioria das proteínas pode ser desnaturada pelo calor, pois a agitação térmica interfere nas interações estabilizadoras da estrutura tridimensional dessas moléculas. Quando uma solução contendo proteína é aquecida em certas condições, ocorre a formação de flocos insolúveis em água. Este fenômeno é chamado de “coagulação pelo calor”. O termo coagulação normalmente significa uma alteração irreversível na proteína, diferente do que ocorre na precipitação por ácidos ou sais de metais pesados, em que é possível a redissolução do precipitado. Cada proteína tem um ponto isoelétrico e quanto mais próximo desse estiver o meio mais rápida ocorrerá a coagulação.

- Objetivo:

Caracterizar a influência do pH na termocoagulação.

- Técnica:

Em um tubo de ensaio, pipeta-se 5 ml de solução de ovoalbumina com 1 ml da solução de NaOH 0,1M. Em outro tubo de ensaio, pipeta-se 5 ml de solução de ovoalbumina com 1 ml de solução tampão pH 4,7. Em seguida, coloca-se os dois tubos em banho fervente por 5 minutos.

- [pic 13]Resultado:[pic 14]

Observações:

- No tubo 1 (que continha ovoalbumina e NaOH) não foi observada nenhuma ocorrência.

- No tubo 2 (que continha ovoalbumina em solução tampão) foi notado o aparecimento de flocos de proteína, que se mostraram impossíveis de serem solubilizados, até mesmo através de agitação.

3.4 Conclusão:

No tubo 1, houve repulsão entre suas cargas negativas resultantes da ovoalbumina e os íons hidroxila. Assim, houve a solubilização da proteína, uma vez que o pH aumentou e ficou distante do ponto isoelétrico da mesma. Já no tubo 2, houve a coagulação da ovoalbumina, pois o pH da solução tampão era aproximadamente igual ao ponto isoelétrico da proteína. Houve formação de flocos ou grumos no tubo 2 pois o potencial isoelétrico foi atingido. Uma vez que cada proteína tem seu ponto isoelétrico característico, a coagulação pelo calor será mais rápida se mais próximo estiver o pH do meio do ponto isoelétrico da proteína. Não foi observada nenhuma ocorrência no tubo 1, pois o pH não alcançou o ponto isoelétrico.

4. Solubilização – “salting in”

4.1 Objetivo:

Provar que solução salina em baixa concentração aumenta a solubilidade de muitas proteínas.

4.2 Técnica:

Em um béquer com 3 ml de água destilada, diluir 0,5 ml de solução de ovoalbumina e misturar até que ocorra o aparecimento de um precipitado (as globulinas). Após isso, deve-se adicionar ao béquer, gota a gota, uma solução de cloreto de sódio até o precipitado ressolubilizar.

4.3 Resultados:

Inicialmente, foi observado o aparecimento de flocos. Após a adição de NaCl em baixa concentração e posterior agitação, a solução solubilizou-se novamente.

4.4 Conclusão:

A solução salina promove a formação de uma camada de solvatação, a qual aumenta a interação da proteína com a água, elevando o grau de solubilização da primeira.

5. Precipitação – “salting out”

5.1 Objetivos:

Provar que solução salina em alta concentração aumenta a precipitação de muitas proteínas.

5.3 Resultados:

No tubo do experimento anterior, observou-se o surgimento de flocos após a adição de alta concentração de NaCl.

5.4 Conclusão:

O sal, em quantidade excessiva, consegue interagir com a água, impedindo competitivamente que a proteína também realize interação.

6. Método para “salting in” e “salting out”

Colocou-se clara de ovo com água destilada em um béquer, e agitou-se a mistura com um bastão de vidro, até que houvesse visualização de precipitados brancos (globulinas). Em seguida adicionou-se através de um conta-gotas uma solução de NaCl, até que fosse observada a redissolução do precipitado. Posteriormente, foi acrescido sulfato de amônio à uma alíquota da solução anterior, o que fez com que o precipitado reaparecesse. No início, as globulinas estavam próximas de seu ponto isoelétrico. Assim, elas tendem a se agrupar, formando pequenos coágulos envoltos por uma camada de solvatação. A partir da adição de sal, observa-se a redissolução desses coágulos, pois a força iônica original é restaurada e a camada de solvatação sofre aumento – o que acresce a solubilidade das proteínas. O sulfato de amônio, por sua vez, diminui a camada de solvatação, ou seja,